血清NETs、FIB、miR-374a-5p水平与膝关节置换术后下肢深静脉血栓形成的相关性分析

张新瑞，张珍露，丁帅，张振，王振

下肢深静脉血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)是膝关节置换术后常见并发症，术后下肢DVT 发生率为40%～60%，深静脉造影是DVT 诊断金标准，但其属于有创性检查，且操作过程较为复杂，血清学指标检测操作简便，已成为临床辅助诊断DVT 的常见方法[1]。中性粒细胞胞外陷阱(NETs)是由组蛋白、中性粒细胞内颗粒组成，可结合血管性血友病因子(VWF)、凝血因子Ⅻ(FⅫ)，促进纤维蛋白形成，促使血小板凝集，抑制其表达后可减少静脉血栓形成[2]。纤维蛋白原(FIB)对血管内凝血、血栓形成具有一定预测价值[3]。微小RNA(miRNA)表达失调与DVT 等多种疾病发生发展密切相关，微小RNA-374a-5p(miR-374a-5p)在混合型DVT 中表达水平升高，其高表达可加重DVT 严重程度[4]。目前膝关节置换术后下肢DVT与血清NETs、FIB、miR-374a-5p 相关研究报道相对较少，因此，本研究主要探讨膝关节置换术后下肢DVT 者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平变化，分析其对术后下肢DVT 的预测价值，为临床诊治工作提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年9 月至2023 年5 月于郑州阳城医院进行膝关节置换术患者108 例为研究对象，其中男73 例，女35 例；年龄49～78 岁，平均年龄(63.29±7.02)岁；体质量指数18～30 kg/m2，平均体质量指数(24.01±2.61)kg/m2；原发疾病：创伤性膝关节炎48 例、类风湿性膝关节炎43 例、膝关节坏死13 例、滑膜软骨瘤4 例。本研究经医院伦理委员会审核批准(审批号：YCYY20200815001)，且签署知情同意书。

1.2 选取标准 纳入标准：符合膝关节置换术治疗指征者；未伴有凝血功能异常者；未接受抗凝治疗者；既往未接受下肢血管手术者；未伴有明显出血性倾向；单侧肢体发病者；病程<15 d。排除标准：围手术期出现发热、呼吸道感染者；新冠肺炎感染者；长期使用免疫调节剂者；术后伤口红肿或浅表感染者；术前存在下肢DVT者；既往心脑血管梗阻病史者；合并活动性下肢溃疡者。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法及分组标准 研究对象予以膝关节置换术治疗，且依据参考文献进行手术操作[5]。术后予以抗凝、抗血栓等常规治疗。依据术后7 d是否发生下肢DVT 分为DVT 组、非DVT 组，DVT 标准[6]：压迫远端肢体后，超声未检测到病变处血流信号；静脉管内径扩宽，施加压力后管腔未完全压缩；静脉管腔内径变宽，且可见不同回声实性包块。

1.3.2 收集临床资料 收集研究对象临床资料，包括性别、年龄、手术时间、术中失血量、止血带应用时间、体质量指数、静脉血栓栓塞症风险评估量表(Caprini)评分、基础疾病、原发疾病，其中Caprini 评分包括40 个有关血栓形成的危险因素，每个危险因素依据严重程度分别记为1、2、3、4、5分，分值越高则DVT 发生风险越高[7]。

1.3.3 检测血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平分别于术前、术后1 d、术后3 d 采集两组研究对象空腹外周静脉血5 mL，室温静置30 min 后以3 500 r/min 离心10 min 分离血清，采用MPO-DNA复合物的捕获ELISA 法检测血清NETs 水平(上海化邦生物公司提供)。采用ACL7000 全自动凝血分析仪及其配套检测试剂盒(美国贝克曼库尔特公司)检测血清FIB 水平。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清miR-374a-5p 水平：采用Trizol法(美国Invitrogen 公司)提取血清中总RNA，参照miRNA 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(上海泽叶生物科技有限公司)合成cDNA，以cDNA 为模板进行qRT-PCR 扩增，实验操作过程参照SYBR Green SuperReal 荧光定量预混试剂增强版(北京天根生化公司)，采用StepOne TM 荧光定量分析仪(美国应用生物系统公司)检测获取数据，以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-374a-5p 水平。miR-374a-5p 引物由北京宝日医生物技术公司设计合成，miR-374a-5p正向引物5’-GCCGGTTATAATACAACCTGATAAG-3’，反向引物5’-TATGGTTGTTCTCTGCTCTGTCTC-3’；U6 正向引物5’-CAGCACATATACTAAAATTGGAAC G-3’，反向引物5’-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3’。

1.4 观察指标 ①对比分析两组术前、术后1 d、术后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平，并分析其与Caprini 评分相关性。②分析术后下肢DVT发生的影响因素，并评价术后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平对下肢DVT 发生的预测效能。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0 分析数据，计量资料符合正态分布且以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以率[n(%)]表示，两组间比较采用χ2检验；Pearson 法相关性分析血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平与Caprini 评分相关性；多因素Logistic 回归分析术后下肢DVT 发生的影响因素；绘制受试者工作特征曲线(ROC)，并计算ROC 下面积(AUC)，评价不同血清指标预测下肢DVT 发生的价值，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 术后7 d 下肢DVT发生率为29.63%(32/108)。两组在性别、手术时间、术中失血量、止血带应用时间、体质量指数、基础疾病、原发疾病方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。DVT 组年龄、Caprini 评分高于非DVT 组(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者临床资料比较[n(%)，(±s)]

表1 两组患者临床资料比较[n(%)，(±s)]

注：DVT=下肢深静脉血栓形成，Caprini=静脉血栓栓塞症风险评估量表，下同。

临床参数性别DVT 组(n=32)非DVT 组(n=76)统计值0.028 P 值0.868 DVT 组(n=32)非DVT 组(n=76)统计值P 值男女年龄/岁手术时间/min术中失血量/mL止血带应用时间/min体质量指数/(kg·m-2)Caprini 评分/分22(68.75)10(31.25)65.21±6.07 122.63±20.87 244.19±51.32 63.26±11.08 23.65±2.08 7.22±1.62 51(67.11)25(32.89)62.48±5.72 126.27±22.09 238.57±55.63 65.28±12.71 24.16±3.05 3.16±0.93 2.224 0.795 0.490 0.782 0.864 16.404 0.028 0.429 0.625 0.436 0.390<0.001临床参数基础疾病高血压糖尿病高脂血症原发疾病创伤性膝关节炎类风湿性膝关节炎膝关节坏死滑膜软骨瘤12(37.50)10(31.25)9(28.13)19(25.00)17(22.37)15(19.74)1.719 0.947 0.917 1.076 0.190 0.330 0.338 0.783 14(43.75)13(40.63)3(9.38)2(6.25)34(44.74)30(39.47)10(13.16)2(2.63)

2.2 两组患者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比较 术前两组血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后1 d、术后3 d 两组血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平高于术前；术后1 d、3 d DVT 组血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平高于非DVT 组(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比较(±s)

表2 两组患者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比较(±s)

注：NETs=中性粒细胞胞外陷阱，FIB=纤维蛋白原，miR-374a-5p=微小RNA-374a-5p，下同；与术前比较，*P<0.05；与术后1 d 比较，#P<0.05。

组别DVT 组非DVT 组t 值P 值例数32 76 NETs(吸光度)术前0.20±0.04 0.21±0.05 1.003 0.318 FIB/(g·L-1)miR-374a-5p术后1 d 0.56±0.10*0.37±0.08*10.444<0.001术后3 d 0.45±0.11*#0.36±0.10*4.145<0.001术前2.23±0.44 2.18±0.51 0.484 0.630术后1 d 5.96±0.61*3.31±0.53*22.675<0.001术后3 d 4.62±0.64*#3.28±0.76*8.747<0.001术前1.00±0.06 1.01±0.04 1.015 0.312术后1 d 2.85±0.41*1.88±0.42*11.036<0.001术后3 d 2.41±0.50*#1.83±0.56*5.067<0.001

2.3 术前血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平与Caprini 评分相关性分析 Pearson 法相关性分析显示术前血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平与Caprini评分呈正相关(P<0.05)，见表3。

表3 术前血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平与Caprini 评分相关性分析

2.4 多因素Logistic 回归分析术后下肢DVT 发生的影响因素 多重共线性诊断结果显示术后1 d、术后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平可能存在多重共线性，术后1 d 创伤、疼痛等可引起应激反应，这可能影响血清指标水平变化，因而剔除术后1 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平。以是否发生术后下肢DVT 为因变量(否=0、是=1)，以年龄、Caprini 评分及术后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平为自变量进行Logistic 逐步回归分析，结果显示，Caprini 评分、术后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平为术后下肢DVT 发生的独立影响因素(P<0.05)，见表4。

表4 多因素Logistic 回归分析术后下肢DVT 发生的影响因素

2.5 ROC 分析血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平对术后下肢DVT 发生的预测价值 以DVT 组32例为阳性样本，以非DVT 组76 例为阴性样本，ROC分析显示术后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平联合预测术后下肢DVT 发生的AUC 大于单项指标预测(P<0.05)，见表5。

表5 ROC 分析血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平对术后下肢DVT 发生的预测价值

3 讨论

膝关节置换术后下肢DVT 生成可能与炎性反应、血管内皮细胞炎性损伤、血管内壁损伤、血液高凝状态等有关，膝关节置换术中机体可激活凝血系统，增加凝血酶含量，血液呈高凝状态，术后长时间卧床导致下肢静脉回流受限，可增加DVT 生成风险[8]。

血小板可促进NETs 产生，NETs 可直接与FⅫ结合，将其转化为活化的凝血因子，激活内源性凝血途径，促使天然抗凝物质降解失活，诱导血小板聚集，参与静脉血栓形成过程[9]。本研究结果显示，DVT 组血清NETs 水平高于非DVT 组，与Caprini 评分呈正相关，提示NETs 水平升高与术后下肢DVT 生成密切相关。术中刺激中性粒细胞可释放线粒体DNA，增加NETs 生成量，而下肢血流速度减慢，可引起血液淤积，也可参与NETs 形成，同时NETs 与血小板活化、凝血瀑布反应激活有关，引起血液高凝状态，促进血栓形成，这些过程表明NETs 是DVT 生成的重要因子之一。陈塍林等[10]研究表明术后血清NETs 水平升高可能为膝关节置换术后下肢DVT 生成的影响因素，术后3 d 血清NETs 水平预测术后下肢DVT 生成的AUC 为0.831。本研究发现术后3 d 血清NETs 水平预测术后下肢DVT 生成的AUC 为0.778，分析原因可能与样本量不同有关。FIB 是由肝脏合成的血浆糖蛋白，属于纤维蛋白被纤溶酶裂解的特异性分子标志物，其水平与DVT 生成密切相关，机体凝血活性增强，FIB 水平升高可反映继发性纤溶亢进、高凝状态，抑制机体纤溶过程[11]。本研究结果显示，DVT 组血清FIB 水平高于非DVT 组，与陈潇等[12]研究报道结果相似。同时本研究发现FIB 水平与Caprini 评分呈正相关，其水平升高为术后下肢DVT 发生的危险因素，提示FIB 水平升高可能参与术后下肢DVT 发生过程。分析原因可能为膝关节置换术后破损微小软组织可通过血管进入血液循环系统，激活凝血机制，促使炎性介质释放入血液，而凝血机制亢进可引起DVT，手术操作可加重应激反应，术后肢体活动减少可降低血液流速，加重DVT 程度，血管损伤后FIB 转化为纤维蛋白，可激活凝血因子，加速血液凝固，参与DVT 形成过程。

miRNA 可通过靶向结合下游靶基因，参与调控细胞增殖、分化等过程，其表达异常与类风湿性关节炎等多种疾病发生发展密切相关，miR-374a-5p 可抑制白细胞介素-10(IL-10)表达，导致机体内环境稳态失衡，引起血管内皮细胞炎性损伤，最终导致DVT 形成，但仅从动物实验、细胞实验初步证实miR-374a-5p 可能为DVT 治疗有效靶点[13]。本研究发现DVT 组血清miR-374a-5p 水平高于非DVT 组，且与DVT 发生密切相关。已知miR-374a-5p 可通过与IL-10 结合，引起血管内皮炎性损伤，并可参与血栓形成、冠脉复流等发生过程[14-15]，由此推测miR-374a-5p 水平升高可抑制IL-10 表达，调控炎性因子表达水平，加剧患肢炎性反应，影响静脉血栓溶解再通过程，导致术后下肢DVT 生成。同时本研究还发现术后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平联合预测术后下肢DVT 发生的AUC 大于单项指标预测，可为临床预防DVT 提供循证支持。

综上所述，膝关节置换术后下肢DVT 生成者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平升高，且与DVT形成密切相关，联合检测其水平可预测术后下肢DVT 生成风险，可为防治DVT 提供新思路。