GeneXpert MTB/RIF粪便检测在儿童结核病中的研究进展

李晓迎 方玉莲 宁静 徐勇胜

据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)2022年统计[1],估算2021年全球新发结核病患者1060万例,其中儿童患者约120万例,占11%,其中儿童结核病死亡患者约20万例,占14%。按照2018—2022年联合国高级别会议(UNHLM)里程碑目标,截止到2021年底,只有54%(190万例)儿童结核病患者得到了妥善的治疗(目标350万例)。Dodd 等[2]和Jenkins等[3]估算全球每年新发儿童耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)患者约2.5万～3.5万例,此外,超过50%的儿童结核病患者未被确诊或报告。可见,早期明确诊断、及时治疗对改善患儿预后尤为重要。

有研究显示,涂片镜检结核分枝杆菌(MTB)的阳性率不足15%[4],而MTB培养及菌种鉴定作为诊断结核病的金标准,其阳性率仅为30%～40%[5],结核菌素皮肤试验(TST)联合γ-干扰素释放试验(IGRA)作为临床诊断肺结核的参考标准之一,其不能区分结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核病。而利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert)作为近年新兴起的结核病诊断检测方法,其对成人肺结核的诊断价值已得到大量研究证实[6],WHO也推荐其用于儿童结核病的诊断,但鉴于儿童痰液及胃液标本留取困难,寻找新的无创性操作获取标本并准确诊断儿童结核病已成为当前研究的重点。笔者就Xpert方法检测MTB用于诊断儿童肺结核、肺外结核及粪便标本处理方法及临床应用等方面进行综述,为粪便Xpert检测在儿童结核病诊断中的应用提供参考。

一、粪便Xpert应用优势

由于儿童结核病诊断过程中痰液或胃液抽吸物样本获得较困难,目前其在儿童结核病诊断中的敏感度较低[7],其次,儿童体液量较少,胸腔积液、脑脊液、肺泡灌洗液、胃液等样本量采集量不足;且儿童配合度低,采集标本质量差[8],这就使得儿童结核病的诊断更加困难。

Cordova等[9]指出,含MTB的痰可被吞咽,特别是在睡眠期间,抗酸杆菌也已被证明可在消化过程中存活,并可在粪便中检测到,因此,粪便Xpert检测用于诊断肺结核是可行的,而Liu等[10]研究成果中指出Xpert检测粪便标本在儿童和青少年结核病的治疗管理中有重要的诊断价值。同时针对Xpert检测敏感度低的特点,随着新一代测序技术GeneXpert MTB/RIF Ultra(简称“Xpert Ultra”)出现,补充了Xpert检测敏感度低的问题[11],Xpert Ultra较Xpert增加了IS1081和IS6110区域探针,提高了MTB的检出率。

二、粪便Xpert检测样本处理方法

不同的粪便样本处理方法可能会影响结果的敏感度及特异度,从而影响最终的诊断结果,因此,标本的处理方法至关重要,目前国际及国内尚无统一的粪便处理方法,已知用于Xpert检测的粪便处理方法如下:

1.离心法:其主要是应用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)对样本进行处理, Chipinduro等[12]采用0.15 g大便方法,将收集好的粪便于2～8 ℃中运输,在-80 ℃ 中冷冻储存(储存后在6个月内对标本进行处理),收集合适量的粪便后,将粪便解冻后取0.15 g 置于2.4 ml PBS中混匀,室温静置20 min,取上清1 ml,3500 r/min离心15 min,弃掉上清,在1 ml PBS中重新悬浮,然后用样品试剂2∶1稀释,加入Xpert试剂盒中进行化验。需注意离心法中粪便处理方法及在PBS混匀后的静置时间略有不同[13-15];此外,离心法需要较高级别的生物安全措施[16]。

2.缓冲液制备法:属于非离心法,需格外配置缓冲液。AL缓冲液(Qiagen, Valencia, CA)+10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+2 ml Xpert样品试剂 (SR)+3 mm玻璃微珠。与大便混匀后,室温下孵育30 min,将获得样品通过玻璃棉注射器过滤器放入单独容器中,再将2 ml滤液放入Xpert试剂盒中[17-18]。

3.TS法(two-step processing method):简称两步法,是一种接近痰液处理流程的方法,取1 g粪便样本,用木质涂布棒将其添加到10 ml PBS(pH值为7.4)溶液中,剧烈振荡混匀,沉淀10 min后,取2 ml 上清液与2～4 ml Xpert样品试剂混匀,孵化15 min后,取2 ml混合物进行测试[19]。

4.优化蔗糖浮选法(optimized sucrose flotation,OSF):该方法为主要检测粪便中寄生虫虫卵的方法,现已用于粪便Xpert检测,在粪便样本中加入56%蔗糖溶液,通过密度梯度从粪便颗粒中分离分枝杆菌[20],具体步骤为:(1)在10 ml 56%蔗糖溶液中加入0.5 g粪便;(2)涡流摇动;(3)漏斗纱布滤过;(4)100×g离心1 min;(5)取上清0.5 ml与1.8 ml Xpert样品试剂混合并涡流摇动。该方法需离心,且至少需要生物安全2级。随后 Lounnas等[21]开发一种新的操作方法,在上述传统方法中进行了改进,称OSF法,其开发并发现了蔗糖处理方法的最佳组合方法,即应用0.5 g标本量,用沉降法代替上述离心,采用玻璃棉过滤,沉淀30 min,稀释比例为1∶3.6。

5.简单一步法(SOS法):此方法是基于重力沉降,其原理类似于痰液Xpert处理方法[22]。取0.8～1.0 g粪便,直接加入至8 ml检测试剂中,混合液进行摇晃静置,将静置后的上层“无碎屑”的上清液转移到Xpert试管中进行检测。SOS检测其对标本处理方法上较其用于痰液处理时有所改进,主要体现在以下几点:(1)加入玻璃珠以改善样品的均匀化,增加MTB的释放量;(2)用PBS稀释类似“TS”方法;(3)按照Banada方法进行过滤。该方法被Jasumback等[23]定义为最适合在低资源配置中实施的方法。

三、粪便Xpert检测肺结核的敏感度和特异度

既往研究发现,不同的研究机构及研究样本敏感度及特异度有一定差异,总体来说,Xpert检测MTB的敏感度为25%～85%,特异度为91.7%～100%[24-28]。而Xpert Ultra检测的敏感度为45.5%～60.3%,特异度为88.1%～100%。

粪便Xpert较适用于呼吸系统标本收集相对较为困难的儿童,国外学者Kokuto等[29]发现在成人痰涂片阳性的肺结核患者中,粪便Xpert检测肺结核的敏感度为100%,痰涂片弱阳性的患者,粪便Xpert检测的敏感度为81%,痰涂片阴性患者中敏感度为50%,非肺结核组粪便Xpert检测均阴性,特异度为100%。此外,Walters等[18]收集了280例疑似肺结核的儿童患者进行粪便检测,并与单一呼吸道标本进行比较,发现其检测的敏感度及特异度分别达到了44.4%和99%以上,粪便Xpert检测的特异度较高,但其敏感度略低于呼吸道标本。

另外,Hasan等[30]比较与儿童粪便Xpert与培养(胃液/痰液)方法诊断儿童肺结核的一致性,发现粪便Xpert检测的敏感度为88.9%(95%CI: 50.7%～99.4%),特异度为95%(95%CI: 81.8%～99.1%),且发现胃液标本与粪便检测结果基本一致。Banada等[17]及Walters等[ 15]研究发现,当粪便Xpert直接与单一胃液或痰液检出率进行比较时,粪便并没有表现出劣势。 我国Liu等[10]使用Xpert Ultra方法对126例儿童结核病患者的粪便、呼吸道标本进行检测并与痰培养、痰涂片等进行比较,发现痰Xpert Ultra检测的敏感度及特异度最高,而粪便与痰Xpert Ultra一致率为84.1%,敏感度为45.5% (95%CI: 35.0%～56.0%),特异度为94.7%(95%CI: 82.0%～99.0%),与MTB培养的敏感度[45.5% (95%CI: 35.0%～56.0%)]相似,但高于痰抗酸染色涂片法[27.3%(95%CI: 18.0%～38.0%)]。

Sun 等[31]对141例儿童活动性肺结核及34例儿童非结核性呼吸系统疾病患者分别采用Xpert和Xpert Ultra方法对粪便样本进行检测,同时采用Xpert Ultra方法检测同一患儿胃液,并与胃液培养及涂片进行比较,发现粪便Xpert Ultra检测的敏感度为60.3% (95%CI: 51.7%～68.3%),特异度为97.1% (95%CI: 82.9%～99.8%);粪便Xpert检测的敏感度为32.6%(95%CI:25.1%～41.1%),特异度为100.0% (95%CI:87.4%～100.0%),Xpert Ultra较Xpert有更高的敏感度,但特异度略低于Xpert,并指出粪便Xpert Ultra可替代胃液Xpert Ultra用于儿童肺结核诊断,且粪便与胃液Xpert Ultra阳性均可作为肺结核的细菌学诊断依据。

2022年世界卫生组织《儿童结核病诊疗指南》[32]指出,在儿童和青少年结核病的管理中明确指出,在具有典型的肺结核症状的儿童中,启用Xpert Ultra对痰液、鼻咽分泌物、胃液和粪便等样本作为结核病的初始诊断及利福平耐药的检测工具,而不是痰涂片/培养和表型药物敏感性试验。

四、粪便Xpert检测肠结核的敏感度和特异度

儿童肠结核患者症状不明显,体征非特异性,临床体征与许多其他疾病相似,如克罗恩病等,因此肠结核的诊断较为困难。

肠道粪便Xpert检测是基于肠结核的干酪肉芽肿性病变可在粪便中脱落分枝杆菌这一假设进行的。关于Xpert用于肠结核诊断方面的研究中, Bellam等[33]应用肠镜取成人肠黏膜组织进行Xpert检测,发现其检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值及准确率分别为32% (95%CI: 15.0%～53.5%)、 100% (95%CI: 78.2%～100%)、 46.88% (95%CI: 40.3%～53.6%)、 100%和57.50% (95%CI: 0.9%～72.9%),但以上均为有创性检查,在儿童中适用性较差。

熊瑜等[34]选取我国3家较大型的医院收集254例疑似肠结核患者进行试验,结果发现以临床诊断为标准,粪便Xpert检测的敏感度和特异度分别为60.4%和100%;粪便抗酸杆菌涂片的敏感度和特异度分别为13.2%和98.3%;粪便BACTEC MGIT 960 培养的敏感度和特异度分别为43.2%和100.0%。粪便Xpert检测的敏感度明显高于抗酸杆菌涂片及BACTEC MGIT 960 培养。

粪便Xpert用于肠结核诊断尤其用于肠结核诊断研究数据较少,其在儿童中的应用有待进一步大样本数据研究。

五、总结与展望

粪便Xpert检测因其检测时间短及有较高的诊断准确性,为诊断儿童肺结核提供了一种新的方法,对于控制结核病的传播有较为深远的影响,且粪便标本获得比较方便,在很大程度上避免了支气管镜等操作获取标本。但目前粪便Xpert检测在方法学上无统一标准,还需大样本研究确定统一的参考标准,为临床的实际应用提供更好的价值。另外,粪便Xpert 阳性也不能作为诊断金标准,无论是肺结核或者肠结核均不能以Xpert阳性作为诊断金标准,此外,粪便Xpert的诊断效能受到感染部位、标本类型、标本质量和合并其他病原感染等因素的影响,需要完善标本采集体系,建立规范的标本采集和检测流程,尤其对于不同年龄阶段儿童的适用性及使用价值。因此,粪便Xpert在儿童结核病诊断中的应用需进一步改良和优化,以便更广泛地应用于临床及不同年龄肺结核的诊断和治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献李晓迎:文章撰写及文章修改;方玉莲:文献检索;宁静:对文章的知识性内容作批评性审阅;徐勇胜:对文章的知识性内容作批评性审阅、支持性贡献