益气甘露方治疗2型糖尿病气阴两虚证血清代谢组学的研究

王艺霖,刘文星,黄晓强,黎崇裕,钟秋萍,黄东晖,许小泽

(1.广东药科大学附属第一医院,广东 广州 510000;2.珠海市中西医结合医院,广东 珠海 519000)

2型糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素抵抗引起的以长期高血糖并伴有多个靶器官损害为临床特点的慢性代谢性疾病[1]。代谢组学是对低分子量代谢产物进行定性与定量分析的一门学科[2],能够阐明生物体代谢过程,目前在糖尿病等疾病的研究中广泛应用[3]。2型糖尿病属于中医学“消渴病”范畴,其发生以气阴两虚为本,燥热津伤为标,气阴两虚证为临床中常见的证型。益气甘露方由《医学衷中参西录》之玉液汤加减化裁而成,以益气养阴清热为主。本研究应用代谢组学技术,以2型糖尿病气阴两虚证患者为研究对象,采用气相色谱-质谱联用方法对益气甘露方治疗前后血清代谢产物进行检测,比较其内源性物质的差异及变化,本研究结果可为中医药治疗2型糖尿病的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年7月—2023年10月于广东药科大学附属第一医院、珠海市中西医结合医院门诊及住院部诊断为2型糖尿病气阴两虚证患者80例作为研究对象。其中,男46例,女34例;年龄 21～71岁,平均(45.62±10.95)岁 。将患者随机分为对照组与试验组,每组40例。两组患者在年龄、病程、空腹血糖、餐后2 h血糖、体质量指数(BMI)、腰围、体质量方面比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。此外,从体检人员中选取了40名与糖尿病患者年龄、性别相匹配的健康人作为健康对照组,其中,男23名,女17名;年龄 20～71岁,平均(43.25±10.16)岁。

1.2 诊断标准

西医诊断标准参照《中国2型糖尿病防治指南》[4],中医诊断标准参照2002年国家卫生部《中药新药治疗消渴病(糖尿病)临床研究指导原则》中2型糖尿病气阴两虚证辨证标准:咽干口燥,倦怠乏力。次证:多食易饥,口渴喜饮,气短懒言,五心烦热,心悸失眠。舌脉:舌红少津液,苔薄或花剥,脉细数无力,或细而弦。具备2项主症和1～2项次症即可诊断。

1.3 纳入标准

患者年龄18～75周岁;符合2型糖尿病诊断标准,空腹血糖<10 mmol/L,经2位主任医师按照上述2型糖尿病中医证型诊断标准严格辨证后,确定诊断为气阴两虚证者。

1.4 排除标准

合并有心、脑、肝等严重疾病,或者对研究中某种药物过敏及无法耐受的患者;妊娠期或哺乳期的妇女;近1个月内发生过糖尿病急性并发症患者;对研究中某种药物过敏、无法耐受者。

1.5 健康对照组选择标准

参与研究的健康人年龄18～75周岁;排除糖尿病、IGT、IFG史,无心脑血管、肝、肾疾病。

1.6 脱落与剔除标准

受试者依从性较差,不能按规定服药,或资料不全影响疗效评价者;研究过程中发生严重不良事件者。

1.7 治疗方法

入组患者均在饮食、运动控制的基础上进行治,嘱患者戒烟、戒酒。对照组:给予二甲双胍(国药准字:H20010716,拜耳医药保健有限公司,)口服治疗,0.1 g/次,3次/d,疗程为12周。试验组给予益气甘露方(组成:黄芪15 g,西洋参5 g,天花粉15 g,山药15 g,山萸肉10 g,葛根15 g,翻白草15 g,乌梅10 g,鸡内金10 g,麦冬10 g,炙甘草3 g)治疗,1剂/d,水煎取汁300 mL,早晚两次温服,疗程为12周。

1.8 观察指标及疗效标准

1.8.1 疗效评价标准

参照《中药新药临床研究指导原则》[5]相关疗效的判定原则。

1.8.2 生化指标检测

采用生化仪检测治疗前后的血糖指标:空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、空腹胰岛素(INS)、餐后2 h胰岛素(INS120′);血脂指标:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.8.3 中医症状积分

观察治疗前、完成治疗后中医症状积分:倦怠乏力、咽干口燥、多食易饥、口渴喜饮、五心烦热、大便干燥的改变情况,分为无、轻、中、重,分别赋 0 分、1分、2分、3分,分数越高代表症状越严重。

1.8.4 代谢组学检测

1) 标本采集:收集全血至真空采血管,静置30 min左右,4 ℃,≤1 300 g 离心10 min。待血细胞完全沉降到管底后,用移液器将上层血清转移到1.5 mL离心管内,每管200 μL,然后冻存于-80 ℃冰箱。

2) 样品前处理:吸取100 μL液体样本于1.5 mL离心管中,在其中加入约400 μL提取液(V(乙腈)∶V(甲醇)=1∶1)含0.02 mg/mL的内标(L-2-氯苯丙氨酸),涡旋混匀30 s后,低温超声提取30 min,把样品于-20 ℃静置30 min。4 ℃,13 000 g离心15 min,移取上清液,氮气吹干,100 μL复溶液(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)复溶,低温超声萃取5 min(5 ℃,40 kHz),4 ℃,13 000 g离心10 min,移取上清液,上机分析。

3) 气相色谱-飞行时间质谱(GC-ToF/MS) 分析:采用超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-Q Exactive HF-X系统对样本进行LC-MS/MS分析。

4)物质鉴定及分析:上机后,将原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐,最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵,同时将质谱信息与代谢公共数据库相互匹配,从而得到代谢物的相关信息。

对预处理后的数据矩阵采用Simca-p软件,进行主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判别分析分析(OPLS-DA)。显著差异代谢物的选择基于OPLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)和t检验P值来确定,根据VIP>1、P<0.05两个条件判定代谢物为显著差异性代谢物。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 两组患者临床疗效

本研究结果显示,对照组临床疗效总有效率为87.50 %,试验组临床疗效总有效率为92.50 %,两组比较差异无统计学意义(P>0.05),且试验组不低于对照组。见表1。

表1 两组患者临床疗效

2.2 两组患者血糖相关指标

本研究结果显示,治疗前,两组血糖及血脂指标相比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,对照组与试验组PG、2 h PG、HbAlc、INS、INS120′与治疗前比较差异均具有统计学意义(P<0.05),且试验组疗效不低于对照组,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。治疗后,两组TC、TG、LDL-C较治疗前比较差异具有统计学意义(P<0.05),且试验组不低于对照组,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者HDL-C与治疗前比较差异均无统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 两组患者血糖相关指标

表3 两组患者血脂相关指标

2.3 治疗前后炎症因子水平变化

本研究结果显示,治疗前,两组血清炎症因子水平比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组炎症因子TNF-α、IL-6、hs-CRP水平与治疗前比较差异具有统计学意义(P<0.05),且试验组不低于对照组,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 两组患者炎症因子

2.4 治疗前后中医症状积分

本研究结果显示,治疗前,两组各中医症状积分比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,对照组咽干口燥、多食易饥、口渴喜饮症状积分与治疗前比较差异具有统计学意义(P<0.05),倦怠乏力、五心烦热、大便干燥症状积分与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05);而试验组各个中医症状积分较治疗前比较差异均具有统计学意义(P<0.05),且试验组优于对照组(P<0.05)。见表5。

表 5 两组患者中医症状积分

2.5 2型糖尿病气阴两虚证与健康人的差异代谢物鉴定

通过OPLS-DA(正交偏最小二乘法)方法,根据VIP>1、 student’st检验P<0.05筛选出区分2型糖尿病气阴两虚证与健康人的差异性代谢物,可作为潜在生物标志物。显著差异代谢物所参与的代谢途径主要涉及脂类代谢和氨基酸代谢。见表6。

表6 2型糖尿病气阴两虚证与健康人的差异代谢物

2.6 差异代谢物含量

本研究对试验组治疗前后、健康人对照组3组的血清差异代谢物进行检测,并绘制主成分分析图(PCA图)。见图1。B1代表试验组治疗前,B2代表试验组治疗后,C代表健康对照组。从图中可以看到,B1、B2、C组聚类明显,且差异显著;B1组与健康对照C组间差异最大,B2组向C组接近,说明经过治疗后,代谢产物的变化逐渐趋近于健康人的水平。

B1.试验组治疗前; B2.试验组治疗后;C.健康对照组。

3 讨 论

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新兴的一门系统生物学,是了解生物体代谢产物功能作用的关键技术之一[6]。代谢组学提供了潜在代谢途径的信息,可以进一步确定糖尿病及其进展机制。应用系统生物学方法研究糖尿病,可以提供一个全面的代谢网络,加深对分子的认识,帮助发现潜在治疗靶点,还可对T2DM药物疗效进行预测[7]。本研究以2型糖尿病患者为研究对象,运用代谢组学技术检测其治疗前后代谢产物的变化,发现其潜在生物标志物主要有溶血磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、二酰甘油、三酰甘油、溶血磷脂、磷脂酰肌醇磷酸、胆甾烯基癸酸酯、二氢生物蝶呤、脲基琥珀酸,主要涉及脂肪酸代谢和氨基酸代谢途径。有研究[8]报道,T2DM患者血液中的游离脂肪酸水平往往处于较高水平,脂质代谢的紊乱会导致糖尿病病情进展,人体肌肉中脂肪酸增加会引发丙酮酸脱氢酶失活,从而导致人体细胞内血糖浓度升高。本研究对试验组治疗前后、健康人对照组的血清差异代谢物进行检测发现,经益气甘露方治疗后,2型糖尿病患者差异代谢产物含量水平逐渐趋近于健康人的水平。

本研究显示:益气甘露方治疗气阴两虚型2型糖尿病总有效率高达92.50%,FPG、2 h PG、HbAlc、INS、INS120′、TC、TG、LDL-C水平与治疗前比较均显著下降(P<0.05),且疗效不低于二甲双胍对照组。经益气甘露方治疗后,IL-6、TNF-α、hs-CRP炎症因子水平较治疗前均下降明显。此外,益气甘露方试验组的中医症状积分经治疗后显著下降(P<0.05),且优于对照组。说明益气甘露方可以有效降低2型糖尿病患者的血糖,调节脂质代谢,减轻全身的炎症反应。益气甘露方由玉液汤加减化裁而成,在玉液汤的基础上,去知母、五味子,增加山萸肉、乌梅、麦冬、炙甘草,与玉液汤原方比较,其养阴生津功效增强。方中重用黄芪益气生津为君药;西洋参补气养阴,天花粉能够清肺胃热,生津止渴;山药、山萸肉补脾固肾,四者共为臣药;葛根生津而止渴;翻白草、乌梅、麦冬清热润燥、生津止渴;鸡内金助脾之健运,运化水谷精微,共为佐药;炙甘草调和诸药,为使药,共奏益气养阴、清热生津之功。

益气甘露方中很多中药成分具有调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗的治疗作用。现代药理学研究[9-19]发现,黄芪、葛根可以通过调控AMPK信号通路发挥糖脂平衡作用,且两药配伍的作用优于单药。西洋参富含皂苷成分,可以降低高血脂大鼠的甘油三酯和胆固醇水平。天花粉分离的酸性蛋白天花粉凝集素、山药的多糖成分对实验动物的糖脂代谢、糖耐量异常具有改善作用。山茱萸提取物可以通过抑制炎症因子、下调Akt磷酸化发挥抗炎作用,其活性成分马钱苷、莫诺苷,对糖脂代谢、氧化应激起积极的调控作用。翻白草中的黄酮、三萜类成分,乌梅提取物、麦冬和炙甘草的有效成分均具有血糖调节和抗氧化、抗炎活性。益气甘露方以多成分、多靶点对糖脂平衡进行协同调节,具有改善糖尿病临床症状的作用。

综上所述,益气甘露方可以有效调节2型糖尿病患者的血糖、血脂水平,改善临床症状,降低炎症反应,其主要参与脂肪酸代谢、氨基酸代谢等重要途径,能够提高患者的生活质量。