肝细胞癌中UBE2S 互作蛋白的筛选及预后模型构建

王小燕, 张 豪, 郭泽皓, 曹 骏, 莫之婧

（1. 桂林医学院智能医学与生物技术学院实验教学中心，广西 桂林 541199； 2. 桂林医学院 广西高校生物化学与分子生物学重点实验室，广西 桂林 541199； 3. 桂林医学院智能医学与生物技术学院生物化学教研室，广西 桂林 541199）

肝癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，全球肝癌的发病率和死亡率呈上升趋势，2020 年有905 677 例新增病例和830 180 例死亡病例［1］，其中中国有410 038 例新增病例和391 152 死亡病例［2］。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 是原发性肝癌中最常见的类型，占原发性肝癌病例的75%～85%［1］，因此寻找相关靶分子并研究其作用机制对肝癌的防治十分重要。

泛素结合酶E2S（ubiquitin-conjugating enzyme E2S，UBE2S）是泛素结合酶家族成员，参与蛋白泛素化降解过程［3］。研究［4-13］显示：UBE2S 与人类多种癌症有关，UBE2S 在胃肠道系统、泌尿系统、神经系统、女性生殖系统、肺和乳腺的肿瘤组织中过表达。UBE2S 驱动结肠癌［4］、膀胱癌［5］、胶质瘤［6］、卵巢癌［7-8］、宫颈癌［9］、乳腺［13］、人肺腺癌［10-11］和非小细胞肺癌［12］细胞的增殖、迁移和侵袭，并与其不良预后有关联。此外，研究［6，8］表明：UBE2S 可能与胶质母细胞瘤的化疗耐药性和卵巢癌奥拉帕尼耐药有关。UBE2S 还可作为一种新的p16 和β-连环蛋白的泛素化调控因子，促进前列腺癌的骨转移［14］。研究［15-17］显示：UBE2S 可增强p53 和p27 的泛素化，促进HCC 发展，并通过磷酸酯酶与张力蛋白同源物/蛋白激酶 B（phosphatase and tensin homolog/protein kinase B，PTEN-AKT）信号通路促进HCC 化疗耐药。本课题组前期研究［18］证实：UBE2S 高表达与HCC 患者不良预后有明显相关性，UBE2S 高表达患者总生存率和无病生存率明显降低。但UBE2S 主要与何种蛋白发生直接或间接作用，进而影响HCC 患者的预后还需要进一步研究。本研究采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation， Co-IP） 技术筛选UBE2S 结合的蛋白复合体并进行液相色谱-质谱联用 仪 （liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS） 分析，将经LC-MS 获得的UBE2S 互作蛋白进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号功能富集分析，筛选出关键蛋白，构建基于UBE2S 互作蛋白的预后模型（UBE2S interaction protein prognosis model，UIPM），分析UIPM 评估HCC 患者预后的价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器RIPA 裂解液（P0013B）、抗Flag 抗体（AF519）、硝酸银快速银染试剂盒（P0017S） 和 化 学 发 光 试 剂 BeyoECLPlus（P0018FM））（上海碧云天生物技术有限公司），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶联的二抗（BA1056，武汉博士德生物工程有限公司），Flag-UBE2S 蛋白表达载体和Co-IP 试剂盒（Bes3011-1）（广州伯信生物科技有限公司）。化学发光成像仪（美国伯乐公司）。

1.2 采用Co-IP 筛选与Flag-UBE2S 特异结合的蛋白对Flag-UBE2S 蛋白表达载体进行测序验证。将Flag-UBE2S 质粒转染人肝癌Hep3B 细胞（本研究室保留并传代），转染48 h 后收获细胞提取总蛋白，分为Input 组（阳性对照组，全细胞裂解液，不进行后续的Co-IP）、Flag 组（实验组，使用抗Flag 抗体进行Co-IP）和IgG 组（阴性对照组，使用IgG 进行Co-IP），按照Co-IP 试剂盒操作说明书进行，获得的蛋白沉淀物用于后续实验。

1.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blotting 法检测各组细胞中Flag-UBE2S 蛋白表达情况分别取Input 组、Flag 组和IgG 组的Co-IP 产物10 μL 进行SDS-PAGE 电泳，然后采用硝酸银快速银染试剂盒进行凝胶染色，分析各组蛋白表达情况。采用RIPA 裂解液提取各组Hep3B 细胞中的总蛋白，采用抗Flag 抗体进行特异性印迹，与HRP 偶联的二抗孵育后，加入化学发光试剂BeyoECLPlus，采用化学发光成像仪进行检测并获取图像，通过灰度值观察各组细胞中Flag-UBE2S 蛋白表达情况。

1.4 LC-MS 分析UBE2S 互作蛋白将Flag 组和IgG 组蛋白沉淀物送至广州伯信生物科技有限公司进行质谱定性鉴定分析，质谱原始文件转换为mgf格式文件，采用Mascot 软件检索Uniprot 数据库获取UBE2S 互作蛋白。

1.5 UBE2S 互作蛋白GO 功能和KEGG 信号通路富集分析采用R 软件ClusteProfiler 包（3.14.3 版本）对UBE2S 互作蛋白进行GO 功能和KEGG 信号通路富集分析，获得UBE2S 互作蛋白的分子功能 （molecular function， MF）、 生物学过程（biological process， BP） 和细胞成分（cellular components，CC）GO 功能富集分析及KEGG 信号通路富集分析数据。

1.6 UBE2S 互作蛋白与癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中HCC 预后相关蛋白的韦恩图分析由TCGA 数据库（https：//portal. gdc. cancer. gov/） 中获取374 例HCC 样本的转录表达数据和相对应的HCC 患者临床信息。采用R 软件survival 包（3.3.1）对数据进行生存分析（以中位值为分界线）获得HCC 预后相关蛋白，以P＜0.05 为差异有统计学意义。采用R 软件ggplot2（3.3.6） 包和VennDiagram 包对互作蛋白与TCGA 数据库的HCC 预后相关蛋白取交集并进行可视化，获得与HCC 预后相关的互作蛋白。

1.7 UIPM 构建和验证为建立HCC 患者风险评分模型，采用R 软件glmnet 包对TCGA 数据库中获取的374 例HCC 样本中预后相关互作蛋白转录表达数据和相对应的HCC 患者临床信息进行LASSO 回归分析，进行1 000 次LASSO 回归迭代和10 倍交叉验证，以减少共线性的影响，提高模型的准确性［19］，从而将互作蛋白缩小为7 个与HCC 预后相关的关键互作蛋白，选取1 000 次LASSO 回归迭代中最高的LASSO 值作为HCC 预后相关互作蛋白的LASSO 系数，并对数据进行可视化得到HCC 的UIPM。

由TCGA 数据库和国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）数据库（https：//dcc.icgc.org/）分别下载 374 例和212 例HCC 样本基因转录表达数据和相应的HCC 患者临床信息。根据UIPM 对每例患者进行风险评分，按评分中位值将患者分为高风险组（374 例） 和低风险组（212 例），采用R 软件survival 包（3.14.3） 通过Kaplan-Meier 分析和Log-rank 检验比较高风险组和低风险组患者总生存时间（overall survival，OS）是否有差异来评估风险模型的预测准确性，并绘制风险生存曲线，以P＜0.05 为差异有统计学意义。采用pROC 包（1.17.0.1）对高风险组和低风险组样本进行时间依赖性受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，进一步评估风险模型的预测准确性，ROC 曲线下面积（area under curve， AUC） 值为0.5～1.0 表示具有50%～100%的预测能力。

1.8 独立危险因素分析和列线图模型构建采用单因素和多因素Cox 回归分析对不同临床特征（T 分期、N 分期、肿瘤状态、种族、年龄及性别）和UIPM 风险评分在HCC 患者预后评估中的价值进行分析，并采用ggplot2 包（3.3.3） 构建森林图，以P＜0.05 为差异有统计学意义。采用RMS包（6.2-0）和survival 包（3.2-10）选取与HCC 患者预后明显相关的临床病理特征和UIPM 风险评分，构建HCC 患者1、3 和5 年生存率预测模型列线图和校准图，患者1、3 和5 年生存率通过由总点轴直线至结果轴画一条垂线来确定。

2 结 果

2.1 Co-IP 筛选 Flag-UBE2S 蛋白Co-IP 产物的SDS-PAGE 银染结果显示：Input 组和Flag 组在相对分子质量35 000 附近均有条带（图1A）。Western blotting 法检测结果显示：Input组和Flag 组均检测到Flag-UBE2S 蛋白（图1B）。

图1 Co-IP 产物检测结果Fig. 1 Detection results of Co-IP product

2.2 LC-MS 分析UBE2S 互作蛋白取Co-IP 样品进行LC-MS 分析，去除IgG 组的非特异性蛋白后结果显示：潜在的UBE2S 互作蛋白有97 个。得分排名前20 位蛋白信息见表1。

2.3 GO 功能和KEGG 信号通路富集分析对97 个UBE2S 互作蛋白进行GO 功能和KEGG 信号通路富集分析，结果显示：与BP 关联明显富集的共有256 条，包括氧化应激反应、凋亡信号通路的调控、细胞对氧化应激的反应和凋亡信号通路中半胱氨酸型内肽酶活性的调控等；与CC 关联明显富集的共有92 条，包括黏着斑、核糖体、肌动蛋白细胞骨架、中间丝和氧化还原酶复合体等；与MF关联明显富集的共有68 条，包括核糖体绑定、抗氧化活性、氧气结合、氧化还原酶活性和腺嘌呤核苷酸跨膜转运蛋白活性等；KEGG 信号通路明显富集的共有22 条，包括核糖体、氨基酸的生物合成、Fcγ 受体（Fc γ receptor，FcγR）介导的吞噬作用、肌动蛋白细胞骨架的调节和病毒致癌作用等。见图2。

图2 UBE2S 互作蛋白的 GO 功能和KEGG 信号通路富集分析Fig. 2 GO functional and KEGG signaling pathway enrichment analysis on UBE2S interacting proteins

2.4 UBE2S 互作蛋白与TCGA 数据库中HCC 预后相关蛋白的韦恩图TCGA 数据库数据中共有5 163 个与HCC 预后明显相关的蛋白。97 个潜在的UBE2S 互作蛋白与TCGA 数据库中HCC 预后蛋白取交集获得40 个互作蛋白（图3），排名前20 位的蛋白见表2。

表2 韦恩图中排名前20 位蛋白信息Tab.2 Informations of top 20 ranked proteins in Venn diagram

图3 UBE2S 互作蛋白与TCGA 数据库中HCC 预后相关蛋白的韦恩图Fig. 3 Venn diagram of UBE2S interacting proteins and HCC prognostic-related proteins in TCGA Database

2.5 UIPM 构建和验证通过LASSO 回归分析，对相关性较高的基因进行过滤，防止过度拟合，以达到减少构建模型所需基因的目的。在LASSO 回归的1 000 次迭代中出现的非零系数越高，该基因预测预后的能力就越强，从而筛选出40 个交集蛋白中的关键蛋白，并得到其最佳LASSO 系数（图4A）。通过交叉验证得到了UBE2S、热休克蛋白家族A 成员8 （heat shock protein family A member 8，HSPA8）、异质性胞核核糖核蛋白H1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1，HNRNPH1）、含TCP1 伴侣蛋白亚基3（chaperonin containing TCP1 subunit 3，CCT3）、真核翻译起始因子2 亚基1 （eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 1，EIF2S1）、活化蛋白C 激酶1 受体（receptor for activated C kinase 1，RACK1） 和肌动蛋白相关蛋白2/3 复合体亚基4（actin related protein 2/3 complex subunit 4，ARPC4） 7 个关键蛋白，用于构建UIPM（图4B）。基于7 个关键蛋白的最佳LASSO 系数和蛋白表达水平，建立UIPM 风险评分公式，UIPM 风险评分=0.105×UBE2S+0.057×HSPA8+0.050×HNRNPH1+0.229×CCT3+0.074×EIF2S1+0.023×RACK1+0.172×ARPC4。根据UIPM 风险评分的中位值（5.076）将TCGA 数据库中374 例患者分为高风险组和低风险组（图4C）。高和低风险组HCC 患者生存率比较差异有统计学意义（P＜0.01）（图4D），表明根据UIPM 进行分组，对患者预后进行预测具有一定的准确性。UIPM 的ROC 曲线结果显示：该模型预测HCC 患者1、2 和3 年UIPM 风险评分的AUC 值分别为0.802、0.732 和0.724，均大于0.7，再次证实该模型可以较好地评估HCC 患者预后（图4E）。

图4 UIPM 的构建和验证Fig. 4 Construction and verification of UIPM

采用ICGC 数据库中肝细胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC） 数据作为外部数据进行验证，根据上述构建模型的风险评分中位值将HCC 患者分为高风险组和低风险组（图5A），高风险组和低风险组HCC 患者OS 比较差异有统计学意义（P=0.008）（图5B），ROC 曲线结果显示：UIPM 模型预测HCC 患者1、2 和3 年生存率的AUC 值接近0.7（图5C），表明该模型可以预测HCC 患者预后，并具有一定的临床适用性。

图5 UIPM 的验证 (ICGC 数据库)Fig. 5 Verification of UIPM (ICGC Database)

2.6 独立危险因素分析和列线图模型构建采用单因素Cox 回归分析对HCC 患者临床特征中T 分期、N 分期、肿瘤状态、种族、年龄、性别和UIPM 风险评分与HCC 患者预后的关系进行分析，结果显示：T 分期、肿瘤状态和UIPM 风险评分与HCC 患者预后有明显相关性（P＜0.05）。多因素Cox 回归分析证实：UIPM 风险评分是HCC 患者的独立危险因素。见图6。

图6 Cox 回归分析森林图Fig. 6 Forest plot of Cox regression analysis

基于Cox 回归分析结果，选取与HCC 患者预后明显相关的临床特征T 分期、肿瘤状态和UIPM风险评分，构建列线图预测模型，结果显示：UIPM 风险评分越高，对预测模型的贡献越大，HCC 患者1、3 和5 年的生存率越低（图7A）。预测模型列线图的校准图显示：患者1、3 和5 年实际生存率线与理想情况灰色线接近，说明该列线图预测能力较好（图7B）。

图7 列线图模型预测和验证Fig. 7 Prediction and verification of nomogram model

3 讨 论

本研究中Co-IP 和LC-MS 分析结果显示：Flag-UBE2S 特异结合的蛋白中存在97 个潜在的UBE2S 互作蛋白；GO 功能和KEGG 信号通路富集分析结果显示：上述互作蛋白与半胱氨酸型内肽酶活性、氧化应激和细胞死亡有关。半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化下与谷氨酸结合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸在谷胱甘肽合成酶催化下生成谷胱甘肽［20］。细胞膜中脂质氢过氧化物的过度积累可引起铁死亡，而谷胱甘肽在谷胱甘肽过氧化物酶催化下，可以将过氧化脂质还原为脂醇，抑制铁死亡［21-22］。研究［23-24］表明：氧化应激的关键转录因子核因子E2 相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，NRF2） 可以通过激活多个经典靶基因的表达来缓解铁死亡，而氧化应激是有机体进行有氧代谢时产生的活性氧过度堆积而产生的，也能导致细胞死亡。以上结果均提示：上述互作蛋白可能通过影响细胞氧化应激和铁死亡来影响HCC 的发生发展。

本研究中韦氏图分析结果显示：97 个潜在的UBE2S 互作蛋白中有40 个与HCC 预后有关联，且其中一些蛋白已被证实与HCC 有关。微管蛋白α 家族1c（tubulin alpha 1c，TUBA1C） 促进肝细胞癌的迁移和增殖，并与HCC 预后不良有关［25］；烯醇化酶1（enolase 1，ENO1） 调节整合素α6β4的表达，促进HCC 的生长和转移［26］；血清外泌体HNRNPH1 可作为肝细胞癌的新标志物［27］；Wilms瘤1 关联蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP） 通过m6A-HuR 依赖的重组ETS 原癌基因1（ETS proto-oncogene 1，ETS1） 表观遗传沉默促进HCC 的进展［28］。大多数互作蛋白与HCC的关系尚未见报道，如H2A 组蛋白家族成员Z1（H2A histone family member Z1，H2AZ1）、异柠檬酸脱氢酶3（NAD+）β［isocitrate dehydrogenase 3（NAD+）beta，IDH3B］、RAS 相关蛋白Rab-6A（RAS-related protein Rab-6A，RAB6A） 和核糖体蛋白L18（ribosomal protein L18，RPL18）等，本研究结果为今后对HCC 的研究提供了更多的候选蛋白和新的研究思路。

本文作者构建了较为准确的UIPM 用于HCC患者生存风险评分，且TCGA 和ICGC 数据库数据的生存曲线和ROC 曲线均证实了该模型的准确性，UIPM 风险评分结果显示： UBE2S、 HSPA8、HNRNPH1、CCT3、EIF2S1、RACK1 和ARPC4蛋白表达水平越高，UIPM 风险评分也越高。已有研究［18，29-31］表明：UBE2S 高表达与HCC 患者不良预后存在明显相关关系，HSPA8 在HCC 中高表达并与肿瘤免疫有关，RACK1 可促进HCC 的发生，ARPC2 可促进HCC 细胞增殖和侵袭，与本研究UIPM 风险评分结果一致，表明上述7 个预后相关蛋白促进了HCC 的发生发展。本研究中单因素和多因素Cox 回归分析结果显示：UIPM 风险评分是HCC 患者的预后独立危险因素，结合传统临床特征和UIPM 风险评分构建了列线图，UIPM 风险评分对整个列线图的预后评分贡献大。本研究结果提示：包含UIPM 风险评分的列线图是预测HCC 患者预后的简单而准确的方法。

综上所述，本研究筛选了97 个UBE2S 的互作蛋白，其中40 个蛋白与HCC 预后相关，获得7 个关键蛋白，构建了UIPM，且UIPM 风险评分是HCC 患者的预后独立危险因素。此外，本研究表明：UBE2S 对HCC 的影响可能与氧化应激和铁死亡有关，该结果为揭示UBE2S 在HCC 发生发展中的作用提供了新的理论依据，同时上述40 个互作蛋白和7 个预后相关蛋白为进一步研究HCC 发生发展机制提供了新的研究方向。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

王小燕参与实验操作、数据分析和论文撰写，张豪、郭泽皓和曹骏参与实验操作、数据分析和论文修改，莫之婧参与研究立项、实验设计、数据分析、论文撰写和论文修改。