鹿茸多肽对骨质疏松模型大鼠的改善作用及对SIRT1/FOXO1信号通路的影响

迟雪婷, 黄晓巍,2, 陈芳园, 周高峰, 王晋冀, 律广富, 林 喆, 龚 庆

（1. 长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林 长春 130117；2. 长春中医药大学东北亚中医药研究院基础研究所，吉林 长春 130117；3. 长春中医药大学 吉林省人参科学研究院中药药理组，吉林 长春 130117；4. 长春中医药大学附属医院骨科中心，吉林 长春 130021）

骨质疏松症（osteoporosis，OP） 是通过减少骨量和劣化微观组织结构来实现对全身骨骼系统改变的病症，即骨小梁细化、消失和孔隙变大，从而导致骨脆性增加，骨生物力学性能下降，荷载功能降低，最终导致骨小梁的断裂［1］。OP 已影响全世界数以百万计的人，其中对老人和绝经后女性的影响尤为明显，其主要病理机制是骨吸收与骨形成在整个骨代谢过程中的不平衡［2］。鹿茸为未骨化的雄性马鹿或梅花鹿的幼角［3-4］。鹿茸多肽（velvet antler polypeptide，VAP） 是鹿茸的主要药用活性成分。本课题组前期研究［5-6］证实：聚丙交酯-乙交酯微球搭载VAP 对OP 模型大鼠具有明显的保护作用；VAP 能够增强由东莨菪碱引起的轻度认知障碍大鼠的学习和记忆能力，增加大鼠体内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，同时减少丙二醛（malondialdehyde，MDA） 的产生。氧化应激是由于氧化还原系统平衡被机体内过剩的活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基或缺乏抗氧剂所打破，氧化应激可导致很多组织损伤，最终可能会引起生物体的衰老甚至死亡［7］。研究［8］表明：氧化应激介导骨吸收和形成的平衡系统，通过直接或间接的方式发挥作用，早衰鼠模型表现出OP 的症状和状态与氧化应激损伤有关［9］。VAP 在体外可促进成骨细胞分化，对破骨细胞有抑制作用［10］。但VAP 在体内通过何种途径对OP发挥作用及其作用机制尚未完全阐明。本研究通过探讨VAP 对地塞米松所致OP 模型大鼠的影响，阐明VAP 通过抗氧化应激对OP 的作用机制，为临床OP 的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器12 周龄SPF 级SD 大鼠60 只，雌雄各半，体质量180～220 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（吉） 2020-0002。VAP 由长春中医药大学药学院制备，每1 g VAP 约含生药鹿茸28.9 g，批号：20201120。阿仑膦酸钠（批号：H20160100，杭州默沙东制药有限公司），组织及血液碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP） 活性检测试剂盒、血磷（phosphorus，P） 检测试剂盒、血钙（calcium，Ca2+） 检测试剂盒、SOD 活性检测试剂盒、MDA 检测试剂盒、沉默信息调节因子1 （silent information regulator 1，SIRT1） 抗体、 RUNX 家族转录因子 2 （Runt-related transcription factor 2，RUNX2）抗体、叉头框蛋白O1 （forkhead box protein O1，FOXO1）抗体和过氧化氢酶（catalase，CAT）抗体（北京索莱宝科技有限公司），大鼠骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和大鼠骨钙素（osteocalcin，OCN）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 试 剂 盒 （ 货 号： MM-0115R2 和MM-20603R2，江苏酶免生物科技有限公司），BCA 测定蛋白浓度试剂盒（货号：P0012s，上海碧云天生物技术有限公司）。双能X 射线骨密度仪（型号：Discovery Wi，美国HOLOGIC 公司），多功能微孔酶标仪（型号：Multiskan FC，美国赛默飞世尔科技公司），生物显微镜（型号：DM250，德国LEICA 公司），电泳仪（型号：BE6085，美国Bio-Rad 公司），多功能化学发光成像仪（型号：Q9-Aliance，英国UVltec 公司）。

1.2 实验动物分组和OP 模型制备60 只SD 大鼠适应性喂养3 d，随机分为对照组、模型组、阳性药组、低剂量VAP 组、中剂量VAP 组和高剂量VAP 组，每组10 只。除对照组外其余各组大鼠肌肉注射地塞米松（2 mg·kg-1）复制OP 大鼠模型，对照组大鼠肌肉注射等体积生理盐水，每周2 次，连续11 周。造模的同时，低、中和高剂量VAP 组大鼠分别灌胃给予100、200 和300 mg·kg-1·d-1VAP，对照组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，阳性药组大鼠灌胃给予阿仑膦酸钠2 mg·kg-1·d-1，连续75 d。末次给药2 h 后，大鼠麻醉后进行腹主动脉取血，收集同组大鼠血清，-80 ℃保存备用。

1.3 双能 X 射线骨密度仪检测各组大鼠股骨骨密度（bone mineral density， BMD）处死大鼠后，取各组大鼠右侧股骨长度约1 cm，采用双能 X 射线骨密度仪按照仪器说明书操作检测各组大鼠股骨BMD（mg·cm-2）。

1.4 ELISA 法检测各组大鼠血清中Ca2+、P、OPG、ALP 和OCN 水平按照ELISA 试剂盒说明书中的方法分别检测各组大鼠血清中Ca2+、P、OPG、ALP和OCN水平，单位分别为mmol·L-1、mmol·L-1、μg·L-1、U·L-1和ng·L-1。

1.5 生化法检测各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平按照试剂盒说明书中的方法分别检测各组大鼠血清中SOD 活性（U·mL-1）和MDA 水平（μmol·L-1）。

1.6 HE 染色观察各组大鼠骨组织病理形态表现实验完成后，剥离各组大鼠股骨，4%多聚甲醛固定，分别加入酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制成石蜡切片。经过HE 染色，中性树脂封片，显微镜下观察各组大鼠骨组织病理形态表现。

1.7 Western blotting 法检测各组大鼠骨组织中SIRT1、CAT、RUNX2 和FOXO1 蛋白表达水平取出-80 ℃超低温环境中冻存的各组大鼠股骨组织，常温静置解冻，剪碎，于匀浆管中裂解、匀浆并破碎，取上清液采用BCA 法测定蛋白浓度，配制电泳液和转膜液，配胶、上样、转膜和5%脱脂奶粉封闭，剪膜，加一抗摇床过夜，室温孵育二抗，ECL 显色，以β-actin 为内参，采用凝胶成像系统进行分析并保存，采用Image J 图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平= 目的蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值。

1.8 统计学分析采用 SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠股骨BMD，各组大鼠血清中Ca2+、P、OPG、ALP、OCN、MDA 水平和SOD 活性，各组大鼠骨组织中相关通路蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠股骨BMD与对照组比较，模型组大鼠股骨BMD 明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药组、中剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠股骨BMD 明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠股骨BMDTab.1 BMD of femur tissue of rats in various groups(n=10，，mg·cm-2)

表1 各组大鼠股骨BMDTab.1 BMD of femur tissue of rats in various groups(n=10，，mg·cm-2)

*P＜0.05 vs control group； △P＜0.05， △△P＜0.01 vs model group.

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2.2 各组大鼠血清中Ca2+、P、OPG、ALP 和OCN水平与对照组比较，模型组大鼠的Ca2+、P 和OPG 水平明显降低（P＜0.05），ALP 和OCN 水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量VAP 大鼠血清中OPG 水平明显升高（P＜0.05），阳性药组、中剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠血清中Ca2+、P 和OPG 水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），阳性药组和各剂量VAP 组大鼠血清中ALP 和OCN 水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清中Ca2+、P、OPG、ALP 和OCN 水平Tab.2 Levels of Ca2+, P, OPG, ALP, and OCN in serum of rats in various groups(n=10，）

表2 各组大鼠血清中Ca2+、P、OPG、ALP 和OCN 水平Tab.2 Levels of Ca2+, P, OPG, ALP, and OCN in serum of rats in various groups(n=10，）

*P＜0.05 vs control group； △P＜0.05， △△P＜0.01 vs model group.

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2.3 各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平与对照组比较，模型组大鼠血清中SOD 活性明显降低（P＜0.05），MDA 水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药组、中剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠血清中SOD 活性明显升高（P＜0.05），阳性药组和各剂量VAP 组大鼠血清中MDA 水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平Tab. 3 Activities of SOD and levels of MDA in serum of rats in various groups(n=10，）

表3 各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平Tab. 3 Activities of SOD and levels of MDA in serum of rats in various groups(n=10，）

*P＜0.05 vs control group； △P＜0.05， △△P＜0.01 vs model group.

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2.4 各组大鼠骨组织病理形态表现显微镜下观察：对照组大鼠骨密质较厚且均匀，骨细胞排列整齐，骨小梁粗壮，结构连接密切；与对照组比较，模型组大鼠骨密质薄弱，骨细胞数量减少，排列混乱，骨小梁变细，呈大块断裂状态，髓腔变得更扩展；与模型组比较，阳性药组、中剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠骨密质明显变厚，骨小梁粗壮，排列交错紧密。见图1。

图1 各组大鼠骨组织病理形态表现（HE，×200）Fig. 1 Pathomorphology of bone tissue of rats in various groups (HE，×200)

2.5 各组大鼠骨组织中SIRT1、RUNX2、CAT 和FOXO1 蛋白表达水平与对照组比较，模型组大鼠股骨组织中SIRT1、RUNX2、CAT 和FOXO1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药组、中剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠骨组织中SIRT1、RUNX2、CAT 和FOXO1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），低剂量VAP 组大鼠骨组织中SIRT1、RUNX2、CAT和FOXO1 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2 和表4。

图2 各组大鼠骨组织中SIRT1、RUNX2、CAT 和FOXO1 蛋白表达电泳图Fig. 2 Electrophoregram of expressions of SIRT1,RUNX2, CAT, and FOXO1 proteins in bone tissue of rats in various groups

表4 各组大鼠骨组织中SIRT1、RUNX2、CAT 和FOXO1 蛋白表达水平Tab. 4 Expression levels of SIRT1, CAT, RUNX2 ,and FOXO1 proteins in bone tissue of rats in various groups(n=10，）

表4 各组大鼠骨组织中SIRT1、RUNX2、CAT 和FOXO1 蛋白表达水平Tab. 4 Expression levels of SIRT1, CAT, RUNX2 ,and FOXO1 proteins in bone tissue of rats in various groups(n=10，）

*P＜0.05 vs control group ； △P＜0.05， △△P＜0.01 vs model group.

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3 讨 论

随着全球性老龄化人口的增加，OP 发病率不断升高，患者数量呈逐年递增的趋势，同时由于其致残率极高且在早期不易被发现，OP 已成为全球性的社会医疗问题［11］。目前临床上治疗OP 常用药物主要包括二膦酸盐和锶盐等，但是长期应用此类药物会出现药效逐渐减弱的现象，甚至会出现较多不良反应［12］。中医药治疗骨病有着悠久的历史，作为核心药材的鹿茸在中医临床上广泛应用且未见明显的毒副作用［10，13-14］。VAP 是鹿茸的主要药用成分，对多种原因导致的OP 均有明显的保护作用。随着年龄的增长和雌激素水平降低，OP 会逐渐严重，因此高发人群主要为绝经后的女性和老年人，其次是由糖皮质激素引起的OP［15］。采用糖皮质激素诱导建立动物OP 模型对临床研究人类OP 具有重要意义，目前最常用的糖皮质激素主要有地塞米松和泼尼松龙。本研究采用肌肉注射地塞米松诱导12 周龄的SD 大鼠制备OP 模型，与对照组比较，模型组大鼠股骨BMD 降低，血清中OPG、Ca2+和P 水平降低，ALP 和OCN 水平升高，骨组织中骨小梁稀疏，结构排列紊乱，间隙增大，出现了骨小梁断裂的情况，证实OP 模型建立成功；经VAP 干预后，上述各指标明显改善，且与VAP 的剂量有关，表明VAP 具有治疗OP 的作用。

氧化应激因子MDA 反映机体氧化损伤情况，具有一定的细胞毒性，是机体氧化的最终产物［16-17］。在正常机体环境中，常用MDA 和SOD 判定氧化应激损伤程度。SOD 是一种在机体氧化和抗氧化平衡系统中起着关键作用的抗氧化金属酶，能够有效地清除人体产生的ROS，进而减轻其对组织的损害［18］。本研究结果显示：与对照组比较，模型组大鼠血清中MDA 水平升高，SOD 活性降低，表明糖皮质激素诱导的OP 大鼠体内氧化与抗氧化失衡，处于氧化应激状态；与模型组比较，中和高剂量VAP 组大鼠血清中SOD活性升高，各剂量VAP 组大鼠血清中MDA 水平降低，提示VAP 可以改善大鼠氧化应激状态，增强抗氧化防御进而防止骨吸收，增加骨骼的形成，降低氧化应激对身体的伤害。

SIRT1 是一种在骨组织生理活动中发挥重要作用的去乙酰化酶［19］，通过脱乙酰的作用调节其下游的靶标，如P53 和核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB）［20］。研究［21］显示：SIRT1 作为叉头框蛋白O （forkhead box protein O， FOXO）家族转录因子中的一种共激活剂，通过氧化应激发挥功能，可以有效地促进SIRT1 与FOXO 之间相互作用。SIRT1 可以调节破骨细胞的活性进而起到维持骨量的作用，其机制主要是催化FOXO 的脱乙酰化过程。研究［21-22］表明：SIRT1 与OP 的发展有明显相关性，白藜芦醇治疗的去卵巢OP 大鼠股骨组织中SIRT1 表达上调，可以通过激活SIRT1/FOXO1 信号通路介导抗氧化应激作用进而发挥对OP 的保护作用。RUNX2 可启动成骨过程，是诱导成骨细胞特异基因表达的重要因素［23］。SIRT1 可通过介导SIRT1/FOXO3a 信号通路途径，上调RUNX2 基因的表达。FOXO 反应元件序列位于RUNX2 基因启动子上游，激活SIRT1 后，SIRT1 可以独立提高FOXO3a 表达水平，结合后形成活性复合物SIRT1/FOXO3a，该活性复合物能够在细胞核中作用于上述反应元件序列，间接提高RUNX2 基因的表达， 因此RUNX2 可以被SIRT1 直接或间接激活，促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞［24］。沉默FOXO1 的表达可以降低RUNX2 的表达水平［25］。研究［26］显示：SIRT1 通过去乙酰化的作用机制修饰FOXO1、FOXO3 和FOXO4，并且可以通过此作用调节以上因子的转录活性，上调过氧化氢酶和血红素加氧酶1 的表达进而抑制破骨细胞的形成。本文作者认为VAP 可以介导SIRT1/FOXO1 途径的抗氧化应激作用进而促进骨生成。本研究结果显示：与对照组比较，模型组大鼠骨组织中的SIRT1、RUNX2、CAT 和FOXO1 蛋白表达水平明显降低，证实SIRT1/FOXO1 信号通路参与OP 的发生；给予VAP 干预后大鼠骨组织中的SIRT1、 RUNX2、 CAT 和FOXO1 蛋白表达水平升高，表明在VAP 抗氧化应激治疗OP 的过程中，SIRT1/FOXO1 信号通路起到了积极的正向作用。

综上所述，VAP 对糖皮质激素诱导的OP 大鼠具有明显的保护作用，并且其作用效果呈剂量依赖性，其抗OP 机制可能是通过SIRT1/FOXO1 信号通路介导抗氧化应激反应，进而促进成骨分化，发挥治疗OP 的作用。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

迟雪婷参与实验方案的设计、数据整理分析和论文撰写，黄晓巍、陈芳园、周高峰、王晋冀和律广富参与实验研究过程和数据收集整理，林喆和龚庆参与研究设计指导和论文审校。