下调富含脯氨酸蛋白11 表达对食管癌耐药细胞EC9706/DDP耐药性的影响及其机制

亢春彦, 张秀芝, 周慧聪, 陈 洁

（1. 河南医学高等专科学校病理学教研室，河南 郑州 451191；2. 郑州大学第二附属医院消化内科，河南 郑州 450000）

食管癌是目前全世界最常见的癌症之一，尽管目前的医疗技术已经有很大进展，但食管癌患者5 年生存率仍然较差［1-2］。针对晚期/转移性食管癌，通常采用顺铂（cisplatin，DDP）、紫杉醇和5-氟尿嘧啶等药物进行化疗，然而对上述药物的化疗耐药性是治疗食管癌的主要障碍［3-4］。人食管癌DDP 耐药性的产生可能是食管癌临床化疗失败的重要原因［5-6］。因此，研究逆转食管癌细胞DDP 耐药的有效方法对于提高食管癌临床化疗效果具有重要价值。

研究［7］显示：富含脯氨酸蛋白11 （prolinerich protein 11，PRR11）是一种肿瘤相关蛋白，在食管癌组织中呈高表达，其表达水平与食管癌预后有密切关联。体外研究［8］证实：敲低食管癌细胞中PRR11 的表达，可抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，表明PRR11 在食管癌发生发展过程中发挥重要作用。但PRR11 与食管癌DDP 耐药的关系尚未阐明。本研究通过构建食管癌DDP 耐药细胞株，采用慢病毒干扰耐药细胞中PRR11 的表达，旨在探讨下调食管癌DDP 耐药细胞中PRR11 表达对细胞耐药性的影响，为逆转食管癌DDP 耐药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂人食管癌EC9706 细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DDP 由山东齐鲁制药有限公司生产。胎牛血清、DMEM、Lipofectamine RNAiMax 和TRIzol 试剂购自美国Ausbian 公司， MTT 购自美国APExBIO 公司，PRR11 shRNA 慢病毒及空载慢病毒由上海吉凯基因公司提供（慢病毒滴度均为2×108TU·mL-1），SYBR®Premix Ex Taq 购自宝生物工程（大连）有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国eBioscience 公司，兔抗人PRR11 （ab237526）、 兔 抗 人 P- 糖 蛋 白（P-glycoprotein，P-gp）（ab235954）、兔抗人多药耐药相关蛋白1 （multidurg resistance associated protein1， MRP1）（ab260038）、 山羊抗兔IgG（ab205718） 和兔抗人GAPDH （ab181603） 抗体购自英国Abcam 公司，兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase， PI3K） p110α 抗体、兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗体和兔抗人磷酸化AKT （phosphorylated AKT，p-AKT）抗体购自美国CST 公司。

1.2 细胞培养和耐药细胞株构建采用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 g·L-1链霉素的DMEM 培养基培养人食管癌EC9706 细胞株。收集对数生长期EC9706 细胞，采用DDP 浓度递增间断刺激细胞，建立DDP 耐药细胞株EC9706/DDP：从低浓度（0.05 mg·L-1）DDP 作用48 h 开始，当细胞出现死亡时，PBS 缓冲液清洗细胞，将含药培养液更换为新鲜不含药培养液；待细胞恢复正常生长，无明显死亡细胞时，加入浓度递增的DDP 作用48 h，每次增加0.05 mg·L-1，间断作用直至细胞在含0.5 mg·L-1DDP 的培养液中长期正常生存，则DDP 耐药细胞株EC9706/DDP 构建成功。

1.3 MTT 法检测EC9706/DDP 细胞药敏性分别收集对数生长期EC9706/DDP 和亲本EC9706 细胞，接种于96 孔细胞培养板中，约每孔5×103个细胞。待细胞贴壁后，弃去培养液，加入含有不同浓度（0、2、4、8、16 和32 mg·L-1）DDP 的新鲜培养液继续培养24 h。每孔加入20 μL MTT 溶液（5 g·L-1），37 ℃继续培养4 h。弃去培养液，加入100 μL DMSO，结晶溶解后，酶标仪检测490 nm波长处吸光度（A） 值。根据A 值计算DDP 对EC9706/DDP 细胞和EC9706 细胞的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50），计算耐药指数。耐药指数=IC50（EC9706/DDP 细胞）/IC50（EC9706细胞）。

1.4 细胞转染和分组收集对数生长期EC9706/DDP 细胞，接种于6 孔细胞培养板中，待细胞贴壁且密度达到80%时进行慢病毒转染，按照感染复数50∶1 取PRR11 shRNA 慢病毒和空载慢病毒分别转染EC9706/DDP 细胞，分别为PRR11 干扰（sh-PRR11） 组和阴性对照干扰（sh-NC） 组，另取未进行病毒转染的EC9706/DDP 细胞作为对照组。慢病毒转染6～8 h 后更换新鲜培养基继续培养48 h， 采用实时荧光定量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 法和Western blotting 法检测各组细胞中PRR11 mRNA和蛋白表达水平，以验证干扰效果。此外，采用不同浓度（0、2、4、8、16 和32 mg·L-1）DDP 处理各组细胞24 h 后，采用MTT 法检测各组细胞增殖活性，并计算IC50值。

1.5 RT-qPCR 法检测各组细胞中PRR11 mRNA表达水平分别收集EC9706 细胞、EC9706/DDP细胞和转染后的3 组细胞，采用TRIzol 法提取细胞总RNA。采用反转录试剂盒合成cDNA，采用SYBR 荧光定量试剂盒进行扩增反应。反应条件：95 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 个循环。引物序列： PRR11， 上游引物 5'-GAAGCTGGCTAACATCCTG-3'，下游引物5'-CTCTGGGTTATGCAGTTCTGG-3'；GAPDH，上游引物5'-ATGACCCCTTCATTGACCTCA-3'，下游引物5'-GAGATGATGACCCTTTTGGCT-3'。采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中PRR11 mRNA 表达水平。

1.6 Western blotting 法检测各组细胞中PRR11、PI3K/AKT 信号通路相关蛋白和耐药相关蛋白表达水平①收集耐药EC9706/DDP 细胞及其亲本EC9706 细胞，检测细胞中PRR11 蛋白表达水平；②收集“1.4”中3 组细胞，检测各组细胞中PRR11 蛋白表达水平；③转染后的EC9706/DDP细胞分为sh-NC组、sh-NC+DDP组、sh-PRR11 组和sh-PRR11+DDP 组，其中sh-NC+DDP 组和sh-PRR11+DDP 组EC9706/DDP 细胞慢病毒转染后采用4 mg·L-1DDP 处理24 h，检测各组细胞中PI3K p110α、AKT、p-AKT、P-gp 和MRP1 蛋白表达水平。操作步骤如下：收集细胞沉淀，加入RIPA 裂解液于冰上裂解30 min， 10 000 g、4 ℃离心20 min，收集上清液。BCA 法进行蛋白定量后， 以25 μ g 蛋白的上样量进行10%SDS-PAGE 分离，将蛋白转移至硝酸纤维薄膜。采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入一抗PRR11（1∶500）、PI3K p110α（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT （1∶2 000）、P-gp （1∶1 000）、MRP1（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000），室温孵育2 h。PBS 缓冲液洗膜3 次，加入二抗（1∶20 000），室温孵育2 h。PBS 缓冲液洗膜3 次，加入化学发光试剂，于暗室中曝光显影，分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值；p-AKT 蛋白表达水平以p-AKT/AKT 比值表示。

1.7 流式细胞术检测各组细胞凋亡率收集sh-NC 组、 sh-NC+DDP 组、 sh-PRR11 组 和sh-PRR11+DDP 组细胞，各组取1×106个细胞，加入1 mL 预冷PBS 缓冲液混匀，400 g、4 ℃ 离心5 min。收集细胞沉淀，200 μL 预冷PBS 缓冲液重悬，分别加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC 和PI，混匀，避光孵育30 min。加入300 μL PBS 缓冲液混匀，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.8 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞IC50，各组细胞中PRR11 mRNA 和PRR11、PI3K p110α、p-AKT、P-gp 及MRP1 蛋白表达水平，各组细胞凋亡率，均符合正态分布，以表示，2 组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EC9706/DDP 细胞对DDP 的耐药指数EC9706 细胞和EC9706/DDP 细胞DDP 的IC50值分别为（0.96±0.11） mg·L-1和（6.85±0.14） mg·L-1，EC9706/DDP 细胞对DDP 的耐药指数为7.23±0.86。

2.2 EC9706 细胞和EC9706/DDP 细胞中PRR11 mRNA 及蛋白表达水平与EC9706 细胞（PRR11 mRNA：1.03±0.15，PRR11 蛋白：0.28±0.03 ）比较，EC9706/DDP 细胞中PRR11 mRNA 表达水平（1.78±0.11） 和蛋白表达水平（0.63±0.08）均升高（P＜0.05）。见图1。

图1 Western blotting 法检测2 组细胞中PRR11 蛋白表达电泳图Fig. 1 Electrophoregram of expression of PRR11 protein in cells in two groups detected by Western blotting method

2.3 下调PRR11 基因表达后各组细胞中PRR11 mRNA 和蛋白表达水平及IC50与对照组比较，sh-NC 组EC9706/DDP 细胞中PRR11 mRNA 和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与sh-NC 组比较，sh-PRR11 组EC9706/DDP 细胞中PRR11 mRNA 和蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞中PRR11 mRNA 表达水平（A）、PRR11 蛋白表达电泳图（B）和PRR11 蛋白表达水平（C）Fig. 2 Expression level of PRR11 mRNA (A), electrophoregram of expression of PRR11 protein (B), and expression level of RPP11 protein(C) in cells in various groups

与sh-NC 组 ［（6.63±0.40）mg·L-1］比较，sh-PRR11 组 细 胞 DDP 的 IC50［ （4.39±0.21）mg·L-1］降低（P＜0.05）。

2.4 下调PRR11 基因表达后各组细胞中PI3K/AKT 信号通路相关蛋白和耐药相关蛋白表达水平与sh-NC 组比较，sh-NC+DDP 组和sh-PRR11组细胞中PI3K p110α、p-AKT、P-gp 和MRP1 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；分别与sh-NC+DDP组和sh-PRR11 组比较，sh-PRR11+DDP 组细胞中PI3K p110α、p-AKT、P-gp 和MRP1 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图3。

图3 Western blotting 法检测各组细胞中PI3K/AKT 信号通路相关蛋白和耐药相关蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 3 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of PI3K/AKT signaling pathway related proteins and drug resistance related proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 下调PRR11 基因表达后各组细胞凋亡率与sh-NC组（2.54%±0.27%）比较，sh-NC+DDP 组和sh-PRR11 组细胞凋亡率（24.49%±1.15% 和17.05%±0.76%） 升高（P＜0.05）； 分别与sh-NC+DDP 组和sh-PRR11 组比较，sh-PRR11+DDP 组细胞凋亡率（42.36%±1.19%） 升高（P＜0.05）。见图4。

图4 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig. 4 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

3 讨 论

PRR11 是位于17q22 染色体上与肿瘤相关的基因，在正常组织中其表达水平较低，但在某些肿瘤组织中呈现过度表达趋势，在多种恶性肿瘤细胞生物学行为中发挥重要作用［9-10］。研究［11］显示：抑制结直肠癌细胞中PRR11 基因的表达，可抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移。沉默肝癌细胞PRR11表达，可以使AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammation target of rapamycin，mTOR） 信号通路失活，抑制细胞增殖和迁移，并促进细胞凋亡［12］。研究［13］显示：PRR11 表达上调可能是食管鳞状细胞癌患者生存的独立预后指标，抑制PRR11 基因表达在体内和体外均可抑制食管鳞状细胞癌细胞的迁移和浸润。上述研究表明PRR11在包括食管癌的多种癌症中发挥促癌作用。本研究从DDP 耐药角度出发，通过DDP 浓度递增间断刺激食管癌EC9706 细胞成功获得DDP 耐药细胞株EC9706/DDP，结果显示：EC9706/DDP 细胞中PRR11 mRNA 和蛋白表达水平明显高于亲本EC9706 细胞，推测PRR11 基因可能参与了食管癌细胞DDP 耐药的过程；通过RNA 干扰技术下调EC9706/DDP 细胞中PRR11 基因表达，结果显示：EC9706/DDP 细胞DDP 的IC50明显降低，证实PRR11 基因参与了食管癌细胞对DDP 的耐药。

DDP 为治疗食管癌的关键性药物之一，但化疗耐药限制了DDP 的治疗效果，提高对DDP 的敏感性是食管癌治疗的重要环节。相关研究［14-15］显示：DDP 在癌症中的作用机制可能与抑制PI3K/AKT 信号通路有关，抑制癌细胞中PI3K/AKT 信号通路的激活，有助于提高DDP 的疗效。敲除AKT3 可抑制食管癌细胞的PI3K/AKT 信号通路，降低DDP 治疗的IC50，下调耐药相关蛋白的表达，诱导细胞凋亡，提示PI3K/AKT 信号通路在食管癌细胞DDP 耐药过程中起着重要作用［16］。激活PI3K/AKT 信号通路，可上调耐药相关蛋白（P-gp和MRP1）的表达，导致DDP 对宫颈癌细胞的IC50升高，形成DDP 抗性［17］。MRP1 和P-gp 均为膜结合药物转运蛋白，下调其表达可逆转癌症的多药耐药［18］。研究［19］显示：敲除PI3K p110α 基因和PI3K p110β 基因，可降低ABC 转运蛋白的表达，从而逆转癌细胞耐药，被认为是一种降低肿瘤细胞多药耐药的有效策略。大量研究［11-12，20］显示：PRR11 表达与PI3K/AKT 信号通路有密切联系。沉默PRR11 后，AKT 磷酸化水平降低，其下游关键调节因子活性也明显降低，上调PRR11 表达后p-AKT 及下游因子表达水平明显升高，提示PRR11 可能通过激活PI3K/AKT 信号通路在肿瘤细胞中发挥作用［21］。在本研究中，DDP 干预或下调PRR11 的表达均可诱导EC9706/DDP 细胞凋亡，降低耐药相关蛋白MRP1 和P-gp 及PI3K p110α 和p-AKT 的表达水平，抑制PI3K/AKT 信号通路的活化，且二者联合作用效果更明显。

综上所述，PRR11 参与了食管癌EC9706 细胞对DDP 的耐药过程，下调PRR11 的表达，可增强耐药细胞对DDP 的敏感性，诱导细胞凋亡，PRR11 具有作为食管癌分子标志物和治疗靶点的潜在价值，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT 信号通路的激活有关，后续将通过体内实验进一步验证。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

亢春彦参与实验设计和论文撰写，张秀芝参与统计学分析、实验指导和数据采集，周慧聪参与论文修改和论文审阅，陈洁参与实验设计和指导及提供研究经费。