可溶性CD40 配体通过长链非编码RNA linc00239 对THP-1 细胞生物学行为的影响

封忠昕, 李 梅

（贵州医科大学附属医院血液科，贵州 贵阳 550004）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是成人最常见的白血病类型，约占成人白血病的70%，其发病率随着年龄的增加不断升高［1］。传统的AML 化疗方案尽管有一定的效果，但复发风险较高［2］。目前治疗AML 的有效方法是造血干细胞移植，但供者来源有限，且易引起严重的移植物抗宿主反应［3］。因此，探索新的治疗AML 的方法具有重要意义。

CD40 配体（CD40 ligand， CD40L）属于肿瘤坏死因子受体超基因家族成员，在肿瘤细胞抗原递呈和免疫应答中发挥重要作用［4］。本课题组前期研究［5-7］证实：可溶性CD40L 可以通过抑制磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B， PI3K/AKT）信号通路下调B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3），诱导人单核细胞白血病THP-1 细胞凋亡，还可以有效降低THP-1 细胞阿霉素耐药株的耐药性［8］，CD40L 有望作为AML 治疗的靶点，但CD40L 通过何途径调控PI3K/AKT 信号通路并抑制AML 细胞活性尚未完全阐明，其作用机制有待进一步研究。研究［9］表明：AML 细胞中长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）linc00239 表达水平升高，且对细胞增殖、集落形成和迁移能力等具有促进作用，能够增强AML 细胞对阿霉素的化学耐药性，降低阿霉素诱导的细胞凋亡。基于以上研究背景，本研究拟在THP-1 细胞中过表达或沉默linc00239， 并采用可溶性CD40L 处理， 检测CD40L 对THP-1 细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，分析CD40L 与linc00239 之间的联系，为治疗AML 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人单核细胞白血病THP-1 细胞购于中国科学院上海细胞库。CD40L购于美国PeproTech 公司，RPMI-1640 购于美国Hyclone 公司，胎牛血清购于美国Gibco 公司，TOP10 感受态细菌、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution， PBS）、CCK-8 试剂盒和BCA 蛋白浓度测定试剂盒购于中国Solarbio 公司，HindⅢ和NheⅠ购于美国NEB 公司，T4 DNA 连接酶和逆转录试剂盒购于日本TaKaRa 公司，DNA 回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司， TRIzol 购于美国Ambion 公司， SYBR FAST qPCR Master Mix 购 于 美 国 KAPA Biosystems 公司，氯仿、异丙醇和无水乙醇购于国药集团化学试剂上海有限公司，PI/Rnase Staining Buffer Solution 和AnnexinⅤ-PE/7 AAD 凋亡检测试剂盒购于美国BD 公司，Bcl-2、Bcl-2 关联X 蛋白 （Bcl-2-associated X protein， Bax）、 AKT、GAPDH 和HRP 标记的山羊抗兔二抗购于中国Bioswamp 公司， 磷酸化AKT （phosphorylated AKT，p-AKT）购于美国CST 公司，PVDF 转移膜购于美国Millipore 公司，LipofectamineTM2000 购于美国 Invitrogen 公司， 空载体 （vector）、pcNDA、linc00239 过表达质粒（pcDNA-linc00239）和干扰质粒（sh-linc00239-1、 sh-linc00239-2 和sh-linc00239-3） 购于武汉华联科生物技术有限公司。 实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）仪和电泳仪（型号：CFX-Connect 96）购于美国Bio-Rad 公司，超微量分光光度计（型号：Nano-300）购于杭州奥盛仪器有限公司，倒置荧光显微镜（型号：DMIL LED）购于德国Leica 公司， 流式细胞仪（型号：NovoCyte） 购于杭州安捷伦生物有限公司，酶标仪（型号：MK3）购于芬兰雷勃公司。

1.2 细胞培养及转染THP-1 细胞在含10%FBS的RPMI-1640 培养基中于37 ℃、5%CO2条件下培养。控制细胞密度为2×105mL-1～4×105mL-1，并在细胞生长至8×105mL-1～1×106mL-1时进行传代。转染前1 d 将生长状态良好的细胞均匀铺于6 孔细胞培养板上，细胞生长汇合至70%时，按照LipofectamineTM2000 说明书步骤进行细胞转染。转染过表达质粒时细胞分为3 组：对照组，不做任何处理，正常培养；pcDNA 组，转染pcDNA 质粒；pcDNA-linc00239 组，转染linc00239 过表达质粒。转染干扰质粒时细胞分为5 组：对照组、sh-NC 组、sh-linc00239-1 组、sh-linc00239-2 组和sh-linc00239-3 组，除对照组外分别转染不同linc00239 干扰质粒。转染完成后培养24 h，采用RT-qPCR 法检测各组细胞中linc00239 表达水平，验证转染效率。

1.3 实验分组和处理将细胞分为对照组、vector 组、 pcDNA-linc00239 组、 sh-linc00239 组、vector+CD40L 组、 pcDNA-linc00239+CD40L 组和sh-linc00239+CD40L 组。按照分组方法转染细胞，其中CD40L 处理组均用4 mg·L-1的CD40L 处理细胞24 h［10］，结束后采用RT-qPCR 法检测各组细胞中linc00239 表达水平。

1.4 CCK-8 法检测各组细胞增殖活性调整细胞悬液浓度，加入96孔细胞培养板中，每孔3×103个细胞（100 μL），置 37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。按照“1.3”中的方法进行分组并处理细胞，48 h后取出培养板，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，培养4 h 后采用酶联免疫检测仪测量450 nm 波长处吸光度（A）值，以A 值代表细胞增殖活性。

1.5 流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率收集各组1×107个细胞，1 mL 培养基重悬，400 g 离心5 min，弃上清，300 μL PBS 缓冲液重悬沉淀；加入700 μL 无水乙醇，-20 ℃固定24 h 以上，4 ℃、700 g 离心5 min，弃上清；1 mL 预冷的PBS 缓冲液洗涤2 次后用0.5 mL PI/Rnase Staining Buffer Solution 重悬细胞沉淀，室温孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞DNA 含量，确定细胞在各细胞周期所占百分率， 采用NovoExpress 软件分析结果。

1.6 AnnexinⅤ-PE/7-AAD 染色结合流式细胞术检测各组细胞凋亡率取1×106个培养基重悬的细胞，400 g、4 ℃离心5 min，弃上清；加入1 mL 预冷PBS 缓冲液，混匀，400 g、4 ℃离心5 min，弃上清； 200 μL PBS 缓冲液重悬， 加入5 μL Annexin Ⅴ-PE 和5 μL 7-AAD， 4 ℃避光孵育30 min 后加入300 μL PBS 缓冲液，立即采用流式细胞仪检测，NovoExpress 软件分析结果。细胞凋亡率=右上象限细胞百分率+右下象限细胞百分率。

1.7 RT-qPCR 法检测各组细胞中Bcl-2 和Bax mRNA 表达水平TRIzol 法提取各组细胞总RNA，测定RNA 的纯度和浓度，逆转录获得cDNA，进行RT-qPCR 扩增。RT-qPCR 引物由武汉天一华煜基因科技有限公司合成。扩增体系：SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL，总体积20 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min；扩增95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，共40 个循环。以GAPDH 为内参基因，采用2-△△Ct法计算Bcl-2 和Bax mRNA 表达水平。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab. 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.8 Western blotting 法检测各组细胞中Bcl-2、Bax、AKT 和p-AKT 蛋白表达水平收集各组细胞，取1×106个细胞按照蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，BCA 比色法测定蛋白浓度，蛋白变性冷却后每孔20 μg 加样进行电泳，PVDF 膜进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭4 ℃过夜，加入一抗稀释液（稀释比均为1∶1 000），室温孵育1 h，PBST 洗膜3 次后加入二抗（稀释比为1∶20 000），膜室温孵育1 h，PBST 洗膜3 次后进行曝光显影，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值，p-AKT/AKT比值=p-AKT 蛋白表达水平/AKT 蛋白表达水平。1.9 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞中linc00239 表达水平，各组细胞增殖活性、细胞凋亡率和不同细胞周期细胞百分率，各组细胞中Bcl-2 和Bax mRNA及蛋白表达水平，各组细胞中p-AKT/AKT 比值，均符合正态分布且方差齐，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 linc00239 的转染效率与pcDNA 组比较，pcDNA-linc00239 组细胞中linc00239 表达水平明显升高（P＜0.01）（图1A）。与sh-NC 组比较，各sh-linc00239 组细胞中linc00239 表达水平均明显降低（P＜0.01）， 其中sh-linc00239-1 组细胞中linc00239 表达水平最低，因此选择sh-linc00239-1进行后续实验（图1B）。

图1 各组细胞linc00239 转染效率Fig. 1 Transfection efficiencies of linc00239 in cells in various groups

2.2 各组细胞中linc00239 表达水平与vector 组比较，pcDNA-linc00239 组细胞中linc00239 表达水平明显升高 （P＜0.01）， sh-linc00239 组 和vector+CD40L 组细胞中linc00239 表达水平明显降低 （P＜0.01）； 与 pcDNA-linc00239 组比较，pcDNA-linc00239+CD40L 组细胞中linc00239 表达水平明显降低（P＜0.01）；与sh-linc00239 组比较，sh-linc00239+CD40L 组细胞中linc00239 表达水平明显降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞中linc00239 表达水平Fig. 2 Expression levels of linc00239 in cells in various groups

2.3 各组细胞增殖活性与vector 组比较，pcDNA-linc00239 组细胞增殖活性明显升高（P＜0.01），sh-linc00239 组和vector+CD40L 组细胞增殖活性明显降低（P＜0.01）；与pcDNA-linc00239组比较，pcDNA-linc00239+CD40L 组细胞增殖活性明显降低（P＜0.01）；与 sh-linc00239 组 比较，sh-linc00239+CD40L 组细胞增殖活性明显降低（P＜0.01）。见图3。

图3 各组细胞增殖活性Fig. 3 Proliferation activities of cells in various groups

2.4 各组不同细胞周期细胞百分率与vector 组比较，pcDNA-linc00239 组G1期细胞百分率明显降低（P＜0.05），G2期细胞百分率明显升高（P＜0.05），sh-linc00239 组和vector+CD40L 组G1期细胞百分率明显升高（P＜0.05），G2期细胞百分率明显降低（P＜0.05）；与pcDNA-linc00239 组比较，pcDNA-linc00239+CD40L 组G1期细胞百分率明显升高（P＜0.05），G2期细胞百分率明显降低（P＜0.05）；与sh-linc00239 组比较，sh-linc00239+CD40L 组G1期细胞百分率明显升高（P＜0.05），G2期细胞百分率明显降低（P＜0.05）。见图4 和5。

图4 流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率Fig. 4 Percentages of cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

图5 各组不同细胞周期细胞百分率Fig. 5 Percentages of cells at different cell cycles in various groups

2.5 各组细胞凋亡率与vector 组（9.73%±0.31%） 比较，pcDNA-linc00239 组细胞凋亡率（3.94%±0.45%） 明 显 降 低 （P＜0.01），sh-linc00239 组和vector+CD40L 组细胞凋亡率（28.73%±0.87%和21.87%±0.68%） 明显升高（P＜0.01）；与pcDNA-linc00239 组比较，pcDNAlinc00239+CD40L 组细胞凋亡率 （13.73%±0.70%） 明显升高（P＜0.01）；与sh-linc00239 组比较， sh-linc00239+CD40L 组细胞凋亡率（36.67%±2.15%）明显升高（P＜0.01）。见图6。

图6 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig. 6 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.6 各组细胞中Bcl-2 和Bax mRNA 及蛋白表达水平与vector 组比较，pcDNA-linc00239 组细胞中Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），Bax mRNA 和蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），sh-linc00239 组和vector+CD40L 组细胞中Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），Bax mRNA 和蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与pcDNAlinc00239 组比较，pcDNA-linc00239+CD40L 组细胞中Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），Bax mRNA 和蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与sh-linc00239 组比较，sh-linc00239+CD40L 组细胞中Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），Bax mRNA 和蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。见图7 和表2。

图7 各组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B, C）Fig. 7 Electrophoregram(A) and histograms (B, C) of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in cells in various groups

表2 各组细胞中Bcl-2 和Bax mRNA 表达水平Tab. 2 Expression levels of Bcl-2 and Bax mRNA in cells in various groups (n=3,)

表2 各组细胞中Bcl-2 和Bax mRNA 表达水平Tab. 2 Expression levels of Bcl-2 and Bax mRNA in cells in various groups (n=3,)

*P＜0.01 compared with vector group； △P＜0.01 compared with pcDNA-linc00239 group； #P＜0.01 compared with sh-linc00239 group.

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2.7 各组细胞中p-AKT/AKT 比值与vector 组比较，pcDNA-linc00239 组细胞中p-AKT/AKT 比值明显升高 （P＜0.01）， sh-linc00239 组 和vector+CD40L 组细胞中p-AKT/AKT 比值明显降低 （P＜0.01）； 与 pcDNA-linc00239 组比较，pcDNA-linc00239+CD40L 组细胞中p-AKT/AKT比值明显降低（P＜0.01）；与sh-linc00239 组比较，sh-linc00239+CD40L 组细胞中p-AKT/AKT比值明显降低（P＜0.01）。见图8。

图8 各组细胞中AKT 和p-AKT 蛋白表达电泳图（A）及p-AKT/AKT 比值直条图（B）Fig. 8 Electrophoregram(A) of expressions of AKT and p-AKT proteins and histogram (B) of ratio of p-AKT/AKT in cells in various groups

3 讨 论

近年来，随着肿瘤免疫学研究的深入，不断涌现出许多新的免疫治疗策略，肿瘤的免疫治疗取得快速发展。目前与白血病治疗相关的研究热点是白血病特异性靶抗原的鉴定和通过靶抗原抑制肿瘤微环境的免疫逃逸［11］，因此探索新的白血病治疗靶点和免疫疗法对于AML 的治疗具有重要的现实意义。本研究探讨CD40L 对THP-1 细胞增殖、凋亡和PI3K/AKT 信号通路的影响及可能机制。

lncRNA 在肿瘤的发生、转移和侵袭中起着至关重要的作用［12-13］。linc00239 是AML 细胞的新型肿瘤启动子，并可作为一种潜在的治疗靶点［9］。本研究结果显示：过表达linc00239 能够提高THP-1细胞的增殖能力，而沉默linc00239 的表达可降低THP-1 细胞的增殖能力，表明linc00239 对THP-1细胞的增殖具有促进作用，与前期研究结果一致；THP-1 细胞沉默linc00239 后再用CD40L 处理可使其增殖能力进一步降低，而过表达linc00239 后再用CD40L 处理则逆转了其对细胞增殖的促进作用，且CD40L 能够抑制细胞中linc00239 的表达，表明CD40L 能够通过下调linc00239 抑制THP-1 细胞的增殖。

细胞周期分为间期（G1、S 及G2期）和分裂期（M 期）2 个阶段，细胞周期的调节主要通过G1期的阻滞来实现［14］。本研究结果显示：过表达linc00239 能够明显降低G1期细胞百分率，而抑制linc00239 的表达则会明显升高G1期细胞百分率，表明linc00239 能够减少G1期阻滞，对细胞的生长具有促进作用；CD40L处理沉默linc00239 的THP-1细胞后G1期细胞百分率进一步升高，而CD40L 处理过表达linc00239 的THP-1 细胞后能够逆转其对细胞生长的促进作用，表明CD40L 能够通过linc00239 抑制THP-1 细胞的生长。细胞凋亡和自噬是维持组织稳态的主要因素，凋亡和自噬的失调会促进肿瘤的发生和发展［15-16］。抗凋亡蛋白Bcl-2能够通过抑制促凋亡蛋白Bax 来阻断程序性细胞死亡而不影响细胞增殖［17］。Bcl-2 和Bax 之间的平衡关系决定了细胞凋亡的发生［18］。本研究结果显示：过表达linc00239 能够抑制细胞凋亡，上调Bcl-2 表达并下调Bax 表达，而抑制linc00239 的表达后结果与之相反，表明linc00239 能够抑制THP-1 细胞的凋亡；沉默linc00239 后再用CD40L 处理，细胞凋亡率进一步升高，而CD40L 处理过表达linc00239的THP-1 细胞能够逆转linc00239 对细胞凋亡的抑制作用，表明CD40L 能够通过linc00239 促进THP-1 细胞凋亡。

PI3K/AKT 信号通路参与肿瘤的分化、转移、侵袭和血管生成等过程，在白血病的发生发展过程中也发挥重要作用［19-20］。PI3K 激活后发生磷酸化并激活AKT，AKT 是一种原癌基因，可调控不同细胞的生长、增殖和代谢等［21-22］。研究［9］表明：linc00239 与PI3K/AKT 信号通路的激活有关，linc00239 可作为PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路激活剂发挥作用。本研究结果显示：过表达linc00239 能够提高AKT 蛋白的磷酸化水平，而抑制linc00239 的表达会降低AKT 蛋白的磷酸化水平，表明linc00239 能够促进AKT 蛋白磷酸化；CD40L 处理沉默linc00239 的THP-1 细胞后，细胞中AKT 蛋白的磷酸化水平进一步降低，而CD40L可逆转过表达linc00239 对THP-1 细胞中AKT 蛋白磷酸化的促进作用， 表明CD40L 能够通过linc00239 抑制AKT 蛋白的磷酸化，进而抑制PI3K/AKT 信号通路的激活。

综上所述， CD40L 可通过linc00239 抑制THP-1 细胞增殖和细胞周期进展，并诱导细胞凋亡。本研究为AML 的临床治疗提供了理论依据，但其具体作用机制仍需进一步研究。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

封忠昕参与实验设计、数据整理、统计学分析和论文撰写，李梅参与实验操作、数据收集和论文审校。