人脐带间充质干细胞培养上清对米非司酮处理的人子宫内膜基质细胞存活、凋亡和子宫内膜容受性的影响

武梦雪, 陈士玲, 刘 艳, 米旭光, 林秀英, 付建华, 方艳秋

（吉林省人民医院生殖医学中心，吉林 长春 130021）

子宫壁分为外层（浆膜）、中层（肌层）和内层（黏膜），内层即子宫内膜。子宫内膜分为功能层和基底层。功能层受卵巢性激素调节发生周期性变化。靠近肌层处的基底层主要由子宫内膜基质细胞（human endometrial stromal cells， hEndoSCs）组成，不受性激素影响，不发生周期性变化［1-2］。hEndoSCs 负责子宫内膜蜕膜化、血管重建和免疫细胞招募，在修复子宫内膜损伤中起着关键作用［3］。子宫内膜损伤可导致hEndoSCs 凋亡，细胞活力降低，从而导致子宫内膜萎缩和子宫内膜稳态失衡［4］。内膜损伤后的修复异常导致的宫腔黏连（intrauterine adhesions，IUA） 和薄型子宫内膜，是试管助孕患者胚胎着床失败和不孕的重要原因［5］。干细胞疗法作为一种新型的细胞疗法，可以通过抑制炎症、增强细胞增殖和血管重塑等途径发挥修复组织损伤、抗炎、促血管生成及免疫调节等作用［2］。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs） 来源丰富，易于获取，免疫原性低下，增殖能力强，无伦理性争议，是组织修复和器官重建的理想种子细胞来源，广泛应用于再生医学领域［6-7］。研究［8-13］显示：hUCMSCs 能够改善支气管及肺发育不良和肝功能，治疗成人重度再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、间质性膀胱炎和糖尿病等，也可以修复受损子宫内膜，提高内膜容受性。hUCMSCs 分泌物作为其主要功能物质，修复作用已被证实，但其相关修复机制尚不清楚。本研究拟采用米非司酮（mifepristone， Ms） 处 理 hEndoSCs， 观 察hUCMSCs 培 养 上 清 （hUCMSCs culture supernatant，hUCMSCs-sup） 对hEndoSCs 增殖、凋亡和子宫内膜容受性标志分子表达的影响，并阐明其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂hUCMSC 和hEndoSCs 由吉林省人民医院中心实验室提供。DMEM/F12 基础培养基（SH30023.01）购自美国HyClone 公司，胎牛血清（FB15015） 购自美国Clark 生物公司，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline， PBS）（FG701-01）、青-链霉素双抗（FG101）、Trypsin-EDTA （#FG301-01）、 细胞凋亡检测试剂盒（#FA101-02）、RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司， Ms（M8046）和 自 噬 抑 制 剂 3- 甲 基 腺 嘌 呤（3-methyladenine， 3-MA）（M9281） 购自美国Sigma 公司，MTT 试剂（M8180） 购自北京索莱宝科技有限公司，实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 反应体系SYBR Green 试剂盒购自美国Bio-Rad 公司，GAPDH 抗体（sc-137179）购自上海圣克鲁斯生物技术有限公司，B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（#3498）、 Bcl-2 相关 X 蛋白 （Bcl-2-associated X protein，Bax）（#5023） 和微管相关蛋白1 轻链3B （microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta， LC3B）（#3868） 抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.3 hEndoSCs 的分离和培养hEndoSCs 提取自吉林省人民医院生殖医学中心提供的子宫内膜刺激患者（患者已知情同意）的新鲜子宫内膜组织，由吉林省人民医院中心实验室分离鉴定并传代保存。hEndoSCs 采用含10% 胎牛血清和1% 双抗的DMEM/F12 基础培养基，于5% CO2、37 ℃条件下培养，待细胞铺满平皿，消化传代后用于后续实验。

1.4 MTT 法检测各组细胞存活率将消化后的hEndoSCs 悬液接种于96 孔细胞培养板中（边缘孔用100 μL 0.9% NaCl 填充），每孔8×103个细胞和100 μL 完全培养基，5% CO2、37 ℃条件下培养24 h。hEndoSCs 分为对照组和不同浓度Ms 组，弃掉原培养液，分别加入含0、 40、 60、 80 和100 μmol·L-1Ms 的DMEM/F12 培养基，每组设6 个复孔，分别作用24 和48 h，加入20 μL MTT（5 g·L-1），4～6 h 后移除培养液，加入100 μL DMSO 置于振荡器上震荡10 min，使结晶体充分溶解，采用酶联免疫检测仪于492 nm 波长处检测各组细胞的吸光度（A）值，计算各组细胞存活率。细胞存活率=（实验组A 值-空白组A 值）/（对照组A 值-空白组A 值）×100%。hEndoSCs 分为对照组、Ms 组、Ms+hUCMSCs-Sup 组和Ms+hUCMSCs-Sup+3-MA 组，除对照组处其余各组加入含60 μmol·L-1Ms 的培养基作用24 h，后2 组将培养液分别替换为含50%（体积比）hUCMSCs-Sup 和hUCMSCs-Sup+4 mmol·L-13-MA 的培养液，每组设6 个复孔，培养48 h 后同前处理，计算各组细胞存活率。

1.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率将hEndoSCs 均匀铺于6 孔细胞培养板中，每孔加入2×105个细胞和2 mL 完全培养基，5% CO2、37 ℃条件下培养24 h。 hEndoSCs 分为对照组、40 μmol·L-1Ms 组和60 μmol·L-1Ms 组，弃掉原培养液，分别加入含0、40 和60 μmol·L-1Ms 的培养基，作用24 h 后用0.25%胰酶消化收集于1.5 mL EP 管中，离心机提前预冷至4 ℃，1 000 r·min-1离心5 min，弃掉上清，PBS 缓冲液洗涤3 次，加入100 μL 结合缓冲液悬液制备单细胞混悬液。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和5 μL PI 染液混匀。室温下避光反应10 min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。hEndoSCs 分为对照组、Ms 组和Ms+hUCMSCs-Sup 组，分别加入含0 和60 μmol·L-1Ms 的培养基，作用24 h 后，Ms+hUCMSCs-Sup组培养液替换为含50%（体积比）hUCMSCs-Sup的培养液，培养48 h 后同前处理，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3 次。

1.6 Western blotting 法检测各组细胞中Bcl-2、Bax 和LC3B 蛋白表达水平将hEndoSCs 均匀铺于6 孔细胞培养板中，每孔加入2×105个细胞和2 mL 完全培养基，5% CO2、37 ℃条件下培养24 h。hEndoSCs 分为对照组、40 μmol·L-1Ms 组和60 μmol·L-1Ms 组，处理方法见“1.5”，采用Western blotting 法检测各组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平，计算Bcl-2/Bax 比值。hEndoSCs 分为对照组、Ms 组、Ms+hUCMSCs-Sup 组和Ms+hUCMSCs-Sup+3-MA 组，处理方法见“1.4”，采用Western blotting 法检测各组细胞中LC3B 蛋白表达水平，计算LC3B-Ⅲ/LC3B-Ⅰ比值。

收集各组细胞，提取各组细胞总蛋白，采用BCA 法测定总蛋白含量。每孔分别取15 μg 蛋白上样，将蛋白转移至PVDF 膜上，5 %脱脂奶粉封闭后，加入适量稀释GAPDH （1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和LC3B（1∶1 000）抗体4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶500），室温下摇荡孵育2 h，采用ECL 发光液发光，充分反应后，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平，实验重复3 次。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值。Bcl-2/Bax 比值=Bcl-2 蛋白表达水平/Bax 蛋白表达水平；LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值= LC3B-Ⅱ蛋白表达水平/LC3B-Ⅰ蛋白表达水平。

1.7 RT-qPCR 法检测各组细胞中子宫内膜容受性标志分子mRNA 表达水平将hEndoSCs 均匀铺于6 孔细胞培养板中，分为对照组、Ms 组和Ms+hUCMSCs-Sup 组，每孔加入2×105个细胞和2 mL完全培养基，5% CO2、37 ℃条件下培养24 h；弃掉原培养液，分别加入含0 和60 μmol·L-1Ms 的培养基，作用24 h 后，Ms+hUCMSCs-Sup 组细胞更换为含50%（体积比）hUCMSCs-Sup 的培养液继续培养。培养48 h 后采用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，根据A（260 nm）值对样品总RNA 进行初步定量，逆转录后形成cDNA，采用RT-qPCR 法检测各组细胞中子宫内膜容受性标志分子mRNA表达水平。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40 次；72 ℃终延10 min。采用GAPDH 进行归一化处理。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 表达水平。引物序列：同源框基因A10（homeobox A10，HOXA10），F 5'-AAGCTGAGCTCATCGTTTCC-3'，R 5'-GCACAGGAAAGTCTTGCTAAGG-3'；白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF），F 5'-ATGAACCAGATCAGGAGCC-3'， R 5'-CATAGCTTGTCCAGGTTGTTG-3'； 整合素亚基 β3（integrin subunit beta 3， ITGB3）， F 5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'， R 5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3'；GAPDH，F 5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'， R 5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3'。

1.8 统计学分析采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞存活率和凋亡率，各组细胞中Bcl-2/Bax和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值及HOXA10、LIF 和ITGB3 mRNA 表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度Ms 作用后各组细胞存活率与对照组比较，40、60、80 和100 μmol·L-1Ms 组细胞存活率逐渐降低（P＜0.05）。随作用时间的延长，相同浓度Ms 组细胞存活率逐渐降低，与0 h 比较，作用24 和48 h 时同浓度Ms 组细胞存活率明显降低（P＜0.05）；与24 h 比较，作用48 h 时同浓度MS组细胞存活率明显降低（P＜0.05）。见表1。

目前仍有许多抗血小板聚集药物正在研发，随着科技的发展将会有更多优质药物上市，作为临床医师需要娴熟掌握各种药物的药理学特点才能将更好的治疗带给患者。

表1 不同浓度Ms 作用后各组细胞存活率Tab. 1 Survival rates of cells in various groups after treated with different concentrations of Ms (n=6，，η/%）

表1 不同浓度Ms 作用后各组细胞存活率Tab. 1 Survival rates of cells in various groups after treated with different concentrations of Ms (n=6，，η/%）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with 0 h；#P＜0.05 compared with 24 h.

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2.2 不同浓度Ms 作用后各组细胞凋亡率和细胞中Bcl-2/Bax 比值与对照组比较，40 和60 μ mol·L-1Ms 组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），细胞中Bcl-2/Bax 比值明显降低（P＜0.05）。见图1、图2 和表2。

图1 流式细胞术检测不同浓度Ms 作用后各组细胞凋亡率Fig. 1 Apoptotic rates of cells in various groups after treated with different concentrations of Ms detected by flow cytometry

图2 Western blotting 法检测不同浓度Ms 作用后各组细胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表达电泳图Fig. 2 Electrophoregram of expressions of Bax and Bcl-2 proteins in cells after treated with different concentrations of Ms detected by Western blotting method

表2 不同浓度Ms 作用后各组细胞凋亡率和细胞中Bcl-2/Bax 比值Tab. 2 Apoptotic rates of cells and ratios of Bcl-2/Bax in cells in various groups(n=3，）

表2 不同浓度Ms 作用后各组细胞凋亡率和细胞中Bcl-2/Bax 比值Tab. 2 Apoptotic rates of cells and ratios of Bcl-2/Bax in cells in various groups(n=3，）

*P＜0.05 compared with control group.

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2.3 hUCMSCs-Sup 作用后各组细胞存活率和凋亡率与对照组比较，Ms 组细胞存活率明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与Ms 组比较，Ms+hUCMSCs-Sup 组细胞存活率明显升高（P＜0.05），细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。见表3 和图3。

图3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig. 3 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

表3 各组细胞存活率和凋亡率Tab. 3 Survival rates and apoptotic rates of cells in various groups (n=3,，η/%）

表3 各组细胞存活率和凋亡率Tab. 3 Survival rates and apoptotic rates of cells in various groups (n=3,，η/%）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with Ms group.

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2.4 hUCMSCs-Sup 作用后各组细胞存活率和细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值与对照组比较，Ms组细胞存活率和细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显降低 （P＜0.05）； 与 Ms 组比较， Ms+hUCMSCs-Sup 组细胞存活率和细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B- Ⅰ比值明显升高（P＜0.05）； 与Ms+hUCMSCs-Sup 组比较， Ms+hUCMSCs-Sup+3-MA 组细胞存活率和细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显降低（P＜0.05）。见图4 和表4。

图4 Western blotting 法检测各组细胞中LC3B 蛋白表达电泳图Fig. 4 Electrophoregram of expressions of LC3B protein in cells in various groups detected by Western blotting method

表4 各组细胞存活率和细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值Tab. 4 Survival rates of cells and ratios of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰin cells in various groups(n=3，）

表4 各组细胞存活率和细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值Tab. 4 Survival rates of cells and ratios of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰin cells in various groups(n=3，）

*P＜0.05 compared with control group； △P＜0.05 compared with Ms group； #P＜0.05 compared with Ms+hUCMSCs-Sup group.

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2.5 hUCMSCs-Sup 作用后各组细胞中HOXA10、LIF 和ITGB3 mRNA 表达水平与对照组比较，Ms 组细胞中HOXA10、LIF 和ITGB3 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05），Ms+hUCMSCs-Sup组细胞中HOXA10、LIF 和ITGB3 mRNA 表达水平表达明显升高（P＜0.05）；与Ms 组比较，Ms+hUCMSCs-Sup 组细胞中HOXA10、LIF 和ITGB3 mRNA 表达水平表达明显升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组细胞中HOXA10、LIF 和ITGB3 mRNA 表达水平Tab. 5 Expression levels of HOXA10, LIF, and ITGB3 mRNA in cells in various groups(n=3，）

表5 各组细胞中HOXA10、LIF 和ITGB3 mRNA 表达水平Tab. 5 Expression levels of HOXA10, LIF, and ITGB3 mRNA in cells in various groups(n=3，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with Ms group.

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3 讨 论

在辅助生殖技术中，子宫内膜损伤是不孕患者胚胎着床失败和妊娠丢失的主要原因［14］。与正常子宫内膜比较，受损子宫内膜中相关基因表达水平、形态和功能特征完全改变，细胞凋亡率明显升高［15］。研究［16］表明：hUCMSCs 及其衍生物可以影响细胞增殖和分化等进程，具有改善宫腔黏连和子宫内膜损伤的潜力。

本研究结果显示：Ms 可下调hEndoSCs 存活率，且具有时间和剂量依赖性，并通过调节Bcl-2/Bax通路诱导细胞凋亡。hUCMSCs可修复受损组织，减少细胞凋亡发生［15］，最终通过自身分化及旁分泌作用对损伤子宫内膜进行修复［17］。hUCMSCs-Sup 中含有的外泌体［18］和细胞因子等具有促细胞增殖和抗凋亡作用。hUCMSCs 来源外泌体能够明显促进血管内皮细胞增殖和迁移，抑制内皮细胞凋亡［19-20］。骨髓间充质干细胞条件培养液能促进多发性骨髓瘤细胞的增殖，抑制细胞凋亡，降低Bcl-2 和Bruton 酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK） mRNA 及蛋白表达水平［21］。本研究结果显示：加入hUCMSCs-Sup 后，Ms 处理的hEndoSCs 存活率明显升高，细胞凋亡率明显降低，推测hUCMSCs-Sup 可能通过促细胞增殖和抗凋亡作用恢复受损的子宫内膜。

基础自噬对于维持子宫内膜稳态和介导子宫内膜特异性功能至关重要，包括月经周期、胚胎着床和蜕膜化，并参与早期妊娠［22］。自噬水平在子宫内膜增殖期保持较低水平，但在分泌期明显增加，LC3-Ⅱ和裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase-3）的表达水平也明显升高。此外，自噬水平紊乱可导致子宫内膜异位症、子宫内膜增生、子宫内膜癌、子宫腺肌症和平滑肌瘤等子宫内膜病变及流产［23-24］。研究［25］表明：干细胞可以提高宫腔黏连小鼠子宫内膜的自噬水平，促进血管生成和细胞增殖，提高妊娠率。本研究结果显示：加入hUCMSCs-Sup 后hEndoSCs 中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显上调，提示hUCMSCs-Sup 可激活细胞自噬； 加入自噬抑制剂3-MA 阻断hUCMSCs-Sup 激活自噬后，hUCMSCs-Sup 上调hEndoSCs 存活率的作用受到抑制，推测hUC-MSCs-Sup 可通过激活hEndoSCs 自噬发挥促细胞增殖和抗细胞凋亡作用。

目前普遍认为，ITGB3、HOXA10 和LIF 是评估子宫内膜容受性的重要指标。 ITGB3、HOXA10 和LIF 在胚胎“种植窗”期子宫内膜组织中表达水平明显升高，在反复妊娠失败患者内膜组织中低表达，且与内膜厚度呈正相关关系［26］。ITGB3［27］是重要的细胞黏附分子，主要介导细胞之间的黏附和信号转导，并促进胚泡植入和胎盘滋养层的形成。HOXA10 是同源盒基因家族中的一员，表达于子宫内膜上皮的间质和肌层，对子宫内膜的发育具有时空表达的特异性。LIF 属于白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）超家族［28］，LIF 受体的存在与胞饮突的形成有关，加入干细胞分泌制剂后其表达水平可升高。研究［29］表明：Ms 可明显影响子宫内膜容受性标志物的表达，降低妊娠率。间充质干细胞移植可减少子宫内膜纤维化面积，提高容受性标志物ITGB3 和LIF 的表达，增强大鼠的生育能力［30］。干细胞分泌制剂也可以有效地提高子宫内膜容受性［31］。本研究结果显示：加入hUCMSCs-Sup 后可恢复Ms 下调的hEndoSCs 中容受性相关标志物的表达，提示hUCMSCs-Sup 具有改善子宫内膜容受性的能力。

综上所述，hUCMSCs-Sup 可提高Ms 处理的hEndoSCs 存活率，降低细胞凋亡率，提高子宫内膜容受性，其作用机制可能与hUCMSCs-Sup 激活hEndoSCs 细胞自噬有关。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

武梦雪参与研究设计和论文撰写，陈士玲和刘艳参与研究数据的获取和分析，林秀英和付建华参与论文修改和审校，米旭光和方艳秋参与研究设计。