β-溶血性链球菌对红霉素、克林霉素耐药性及对大环内酯类抗生素耐药机制研究

(1山东医学高等专科学校,山东 临沂 276000;2临沂市人民医院;3山东医专附属医院)

β-溶血性链球菌(Beta-hemolytic streptococci,BHS)主要定植于呼吸道、皮肤、阴道等处,是最常见的社区感染性病原菌之一。红霉素等大环内酯类抗生素广泛用于该菌感染的临床治疗,其耐药问题也引起人们的广泛关注。为了解BHS耐药特性,本研究对其耐红霉素、克林霉素特征进行分析,并检测对大环内酯类药物耐药基因ermB、mefA,分析其耐药表型与耐药基因的相关性,为临床医生选择合理抗菌药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源及鉴定 收集本院2020年6月-2021年12月从门诊及住院患者痰液、咽拭子、脓性分泌物等标本分离的BHS,共64株。将标本接种于哥伦比亚血琼脂培养基,置于5% CO2、37℃培养箱中24 h,使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统及溶血性链球菌血清鉴定试剂盒进行鉴定。

1.2抗菌药物敏感性试验 采用纸片扩散法测定其对红霉素、克林霉素的耐药性,挑取分纯的新鲜菌落悬浮于生理盐水中,震荡混匀后使用麦氏比浊仪,调整浊度为0.5麦氏浓度,将菌液均匀涂布于整个哥伦比亚血琼脂培养基表面,待水分吸收后将药敏纸片贴于培养基表面,纸片中心距培养基边缘不少于15 mm,贴上纸片后将平板倒置,放于37℃温箱中培养。24 h后测量抑菌圈直径,其结果判读参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)M100-S29指南。质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619,购于美国菌种保藏中心。

1.3细菌处理 将细菌分纯培养后,用无菌接种环刮取适量新鲜细菌,加入含有无菌去离子水的EP管中,制成悬液,振荡混匀后100℃加热10 min,高速离心10 min后使用移液枪小心吸取上清液(即为提取的DNA)。测定DNA浓度与纯度后,置于-20℃冰箱中保存备用。

1.4聚合酶链式反应(PCR)扩增 采用软件Primier.5设计部分耐药基因引物,引物委托上海生工生物有限公司合成,利用PCR法对大环内酯类药物相关耐药基因ermB、mefA进行扩增。PCR反应体系为50μL,PCR扩增体系为:2×Taq Master Mix 25μL;上下游引物各0.5μL,模板2μL,ddH2O 22μL;反应条件:94℃预变性3 min,94℃、30s,退火45s,72℃延伸90s,30个循环,72℃延伸7 min。将产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。耐药基因引物序列及产物大小见表1。

表1 耐药基因PCR引物序列

2 结果

2.1药物敏感性实验及耐药表型 BHS对红霉素耐药率为85.9%,对克林霉素耐药率为87.5%。其中82.8%对红霉素、克林霉素均表现为耐药。其中C群链球菌(GCS)对红霉素耐药率最高,其次是A群链球菌(GAS)。B群链球菌(GBS)、GCS对克林霉素耐药率最高,其次是GAS。F群链球菌(GFS)对二者耐药率较低。见表2。

表2 β-溶血性链球菌对红霉素、克林霉素药物敏感性(%)

2.2耐药基因检测结果 ermB基因阳性率为84.4%,其中GCS、GFS对该基因携带率最高均为100%。mefA基因阳性率为3.1%,均在红霉素耐药菌株中检出。另有1株GBH同时携带ermB、mefA基因,7株红霉素敏感菌株中检出ermB基因,与耐药表型不符。见表3,部分耐药基因扩增结果如图 1所示。

图1 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增引物结果

表3 β-溶血性链球菌对红霉素耐药基因分布情况(%)

3 讨论

BHS可引起人类急性扁桃体炎、咽峡炎、丹毒、猩红热、产后感染等,也可合并其它细菌感染引起混合性感染。依据细胞表面C-多糖抗原的血清凝集原理,可将其分为A、B、C、D、F、G等不同亚型。青霉素是治疗BHS的首选用药,但对于对青霉素耐药及过敏者,红霉素及克林霉素为治疗该菌感染的二线推荐用药。随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用,BHS对红霉素、克林霉素的耐药性也引起学者的广泛关注。樊节敏等[1]报道的安徽地区GAS对红霉素、克林霉素耐药率分别为55.0%和70%。2018年CHINET中国细菌耐药性监测报告显示,各组链球菌属对红霉素和克林霉素的耐药率均在56%以上,其中A组BHS对上述两药的耐药率可达90%以上[2]。本研究中BHS对红霉素、克林霉素耐药率分别高达85.9%和87.5%,与黄青等[3]报道类似。其中克林霉素的耐药率较高,可能与大环内酯类药物存在的交叉耐药有关。另外本研究中GAS对红霉素耐药率也达90%以上,与全国耐药监测报道数据相同。其中GCS对红霉素耐药率为100%,GBS、GCS对克林霉素耐药率均为100%,高于张金一等报道[4]。

GBS对大环内酯类耐药机制主要有:erm基因介导的核糖体糖蛋白甲基化,导致药物与核糖体亲和力下降,使菌株产生耐药;mef基因介导的主动外排机制,该基因可诱导红霉素主动排出细胞外,阻止红霉素在菌株内聚集,导致菌株对红霉素表现耐药。黄青等[3]报道的安徽地区ermB、mefA基因检出率分别为45.2%、31.1%,其中GAS、GBS、GGS中ermB基因检出率分别为46.1%、45.2%、60%。本研究中ermB基因检出率为84.4%,mefA基因检出率为3.1%,其中只有GCS红霉素敏感菌株的ermB基因为阴性,GAS、GBS、GGS、GFS在红霉素耐药及敏感菌株中均出现ermB阳性情况,与耐药表型不符。这可能是由于红霉素对BHS作用靶点发生突变导致甲基化为无效修饰或存在某些抑制ermB基因表达的因素有关,具体耐药机制有待于进一步研究。另有1株红霉素耐药的GFS同时携带ermB、mefA基因,说明BHS对红霉素的耐药由多个基因共同引起。

综上所述,本地区BHS对红霉素、克林霉素耐药率较高,且存在多重耐药现象。引起大环内酯类药物耐药与ermB基因无明确相关性,并存在多种耐药基因共同参与的现象,这对临床治疗BHS感染带来一定的挑战。因此,对BHS感染者应适当减少红霉素、克林霉素的使用,并依据药敏结果指导临床用药。