基于响应面法优化沙棘普洱茶粉水提工艺及体外抗氧化能力评价研究

张靖鹏,翟宇晴,张得钧

(青海大学 生态环境工程学院,青海 西宁 810016)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡颓子科沙棘属植物,其果实中含有维生素C、维生素E、氨基酸、胡萝卜素、黄酮类、多酚类等多种生物活性物质,而其叶片中富含茶多酚、氨基酸、脂肪、咖啡碱等成分[1].经对沙棘叶分别以甲醇、水、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯为提取剂进行提取,发现其提取物均具有一定的抗氧化活性[2].此外,研究发现沙棘叶提取物[5]具有调节糖代谢及降糖功效.经验证,10%沙棘叶含药血清可降低高脂细胞模型的脂质累积和降低细胞内的TG、TC水平[3].此外,沙棘叶可以通过抗氧化酶的水平进而减低黄曲霉毒素产生的氧化应激作用[4].

普洱茶是由毛茶[Camelliasinensfs(Linn.)var.assamica(Masters)Kitamura]的鲜叶制作而成的,期间经晒青、杀青、揉捻、日晒等工序,再采用特殊的“渥堆”工艺后发酵而成[5].研究表明,普洱茶中富含茶多酚、咖啡碱、茶素、茶单宁、维生素等活性成分,具有降血脂[6]、缓解酒精性脂肪肝[7]及抗氧化[8]等功效,而其具有的降血脂的作用可能是通过影响鲨烯合成酶催化水平,抑制胆固醇合成,降低细胞内胆固醇浓度及参与肝细胞代谢过程实现的[6].

茶粉又称茶精、速溶茶,是以成品茶为原料,经提取、浓缩、喷雾干燥等工艺制成的粉末或颗粒状产品[9].目前,普洱茶粉制备工艺较为完善,产品稳定性较高[10].茶粉的提取方法包括水浸提法[11]、乙醇浸提法[12]及酶解法[13],其提取液中的可溶性固形物含量是评价茶粉提取率的重要指标之一[11],而得到的茶粉具有较高的茶褐素含量[14],具有较茶相比具有更好的降血脂功效[15].而复配茶提取液具有更好的口感,如沙棘叶与罗汉果、金银花复配,经提取、加入甜味剂和酸味剂制得的复合茶饮料色泽清亮,茶香自然清新,口感清爽[16].综上所述,将沙棘叶与普洱茶经复配、提取、干燥可能制备出具有更高饮用价值的茶粉.

DPPH、ABTS因反应稳定、易操控等特点是体外自由基清除能力评价实验中常用的指示剂,而总还原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)与铜离子还原能力(cupric reducing antioxidant power,CuPRAC)则是通过还原金属离子进行的评估的一种体外抗氧化方法[17].

基于生产成本考虑,首先选择原料配比(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)为研究对象,通过采用单因素分析、Box-Benhnken响应面优化沙棘普洱茶水提工艺,后对不同原料配比的沙棘普洱茶粉进行体外抗氧化实验,进而对沙棘普洱茶粉的制备及功效进行初步研究,进而为沙棘、普洱综合加工、利用提供一定理论及实践参考.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及设备

沙棘叶(青海西宁大通县);普洱茶末(云南茶东家茶叶有限公司,云南昆明);DPPH、ABTS;2,9-二甲基-1,10-菲啰啉(新亚铜灵);L-抗坏血酸标准品(Vc)(Scientific Phygene);FRAP(T-AOC)试剂盒(南京建成生物工程研究所);其余试剂均为国产分析纯;紫外可见光分光光度计(754PC)(上海元析仪器有限公司);酶标仪(ST-360)(上海科华生物工程股份有限公司);数显恒温水浴锅(HH-4)(天津赛得利斯实验分析仪器制造厂);喷雾干燥机组(LPG-5)(江苏先锋干燥工程有限公司);旋转蒸发仪(R5002K)(上海夏丰实业有限公司);数字阿贝折光仪(WYA-3S)(上海仪电物理光学仪器有限公司);紫外可见光分光光度计(754PC)(上海元析仪器有限公司);酶标仪(ST-360)(上海科华生物工程股份有限公司).

1.2 试验方法

1.2.1 沙棘普洱茶粉工艺

将沙棘叶粉碎并与普洱茶末按照配料比(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)混合,加入纯净水,浸泡 0.5 h 后,在一定温度、pH、时间下进行水提,后进行浓缩、喷雾干燥,最终得到沙棘普洱茶粉.

1.2.2 单因素试验

以不同料液比、提取时间、提取温度与pH进行单因素试验,考察不同因素对沙棘普洱茶粉料液中可溶性固形物的影响.除变化量外,试验固定料液比为1∶8(g/mL),提取温度为 80 ℃,提取时间为 3 h,pH为7,分别研究料液比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10 g/mL),提取温度(60、70、80和 90 ℃、沸腾),提取时间(1、2、3、4和 5 h),pH(5、6、7、8、9)对可溶性固形物的影响.

1.2.3 响应面试验设计

根据单因素确定3个水平,以料液比、提取时间、提取温度与pH为试验因素,以可溶性固形物为响应值,采取Box-Behnken中心组合法进行4因素3水平试验设计,试验因素水平见表1.

表1 响应面试验因素水平设计

1.2.4 理化检测

检测料液中可溶性固形物使用《GB/T 12143 饮料通用分析方法》中可溶性固形物的检测方法.检测不同沙棘叶、普洱茶末原料配比下沙棘普洱茶粉产品中相关活性化合物含量(包括：沙棘总黄酮、儿茶素、茶多酚及茶褐素),检测方法：沙棘总黄酮参照《中国药典2020年第一部》沙棘项下,茶多酚、儿茶素参照《GB∕T 8313—2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》,茶褐素参照《NY/T 3675—2020 红茶中茶红素和茶褐素含量的测定分光光度法》.

1.2.5 体外抗氧化能力评价

按照最优提取工艺参数,分别对沙棘叶、普洱茶末及不同沙棘叶、普洱茶末配比(1∶1、1∶4、4∶1)的沙棘普洱茶粉进行提取,后经浓缩、干燥制备得到茶粉样品.

分别称取沙棘茶粉、普洱茶粉、沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶1)、沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)、沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)及Vc 3.5 mg/mL 样本溶液,对上述样本溶液依次进行梯度稀释,得到1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL 浓度梯度的样本及对照品溶液.

1) DPPH抗氧化能力测定 称 2 mg DPPH,用乙醇溶解定容至 25 mL,得到DPPH储备液.吸取DPPH储备液 15 mL 并用乙醇定容至 25 mL,得到DPPH工作液.于96孔板中加入 200μL 的DPPH工作液,再各自加入 5 μL 样本溶液和 5 μL Vc溶液,分别作为样品组和阳性对照组,每隔 5 min 于 517 nm 波长下测定OD值,直至测至 30 min,空白对照组以乙醇代替样本溶液.DPPH自由基清除率计算公式为：

清除率(%)=(OD1-OD2)/OD1×100%

(1)

式中,OD1为空白对照组吸光度,OD2为样本组吸光度.

2) ABTS抗氧化能力测定 称ABTS 57.6 mg,用 0.02 mol/L 醋酸缓冲液溶解,定容至 15 mL.称过硫酸钾 6.6 mg,用 0.02 mol/L 醋酸缓冲液溶解,定容至 10 mL.取 5 mL ABTS溶液和 5 mL 过硫酸钾溶液,混匀后避光反应 12 h,得到ABTS母液.吸取 280 μL ABTS母液,用 0.02 mol/L 醋酸缓冲液稀释至 6.5 mL,避光反应 30 min 后,即得ABTS工作液.

于96孔板中加入 200 μL 的ABTS工作液,再各自加入 10 μL 样本溶液和 10 μL Vc溶液,分别作为样品组和阳性对照组.每隔 10 min 于 734 nm 波长下测定OD值,直至测至 60 min,空白对照组以乙醇代替样本溶液.ABTS自由基清除率计算公式为：

清除率(%)=(OD1-OD2)/OD1×100%

(2)

式中,OD1为空白对照组吸光度,OD2为样本组吸光度.

3) FRAP抗氧化能力测定 以试剂盒提供的实验方法进行实验,于比色皿中加入 1 800 μL FRAP工作液,再分别加入 50 μL 样本溶液,将其置于25～37 ℃ 下孵育 10 min,于 520 nm 波长下检测吸光度,根据吸光度计算公式：

总抗氧化能力(U/mL)=(A1-A2)/0.01÷T×V1/V2

(3)

式中,A1为测定组吸光度,A2为空白组吸光度,T为反应时间(30 min),V1为取样量(mL),V2为反应液总体积(mL).

4) CuPRAC抗氧化能力测定 称取CuCl2·2H2O 4.28 mg 加水溶解,定容 25 mL,摇匀备用;称 19.27 g 醋酸铵加水溶解,定容至 250 mL,摇匀备用;称取 164.89 mg 新亚铜灵(2,9-二甲基-1,10-菲啰啉)加无水乙醇溶解,定容至 100 mL,摇匀,避光保存.

吸取新亚铜灵溶液、CuCl2溶液和醋酸铵溶液各 1 mL,分别加入Vc(3.5 mg/mL)溶液10、20、30、40、50、60 μL 后用无水乙醇补足 4 mL,避光反应 30 min 后在 450 nm 波长下检测OD值.做标准曲线,得回归方程.样本溶液按上述操作加入,加入样品 2.5 μL,反应 30 min 后于 450 nm 波长下检测OD值.根据样品OD值,带入回归方程得到对应的清除Vc-Cu2+还原能力值.

1.2.6 数据分析

试验数据使用SPSS 17软件对数据进行统计分析,每个实验重复3次.试验数据使用SPSS 17软件进行统计分析.数据采用单因素ANOVA分析,以评价两组差异的显著性.使用Design Expert V8.0.5软件对响应面模型进行分析.

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果及分析

2.1.1 料液比对沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影响

由图1可知,当料液比在1∶5～1∶7时,料液的可溶性固形物随着水添加量的增加而增加,说明增加水添加量促进原料中水溶性成分溶出[18].当料液比增加至1∶8以上时,料液中的可溶性固形物含量明显下降,这是由于过多水对料液起到稀释作用[19].

2.1.2 水提温度对沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影响

由图2可知,当温度在60～80 ℃ 时,料液中的可溶性固形物不断增加,说明温度升高可以明显提高原料中水溶性成分溶出.当温度增加至 80 ℃ 以上时,料液中可溶性固形物出现轻微下降及逐步稳定现象,这可能是达到一定温度后,使水溶性物质已基本完全溶出且温度过高会破坏部分活性成分,故而使得温度对其影响不再明显[19].

图1 料液比对沙棘普洱茶粉料液中可溶性固形物的影响

图2 水提温度对沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影响

2.1.3 水提时间对沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影响

由图3可知,在提取时间在 3 h 以内时,料液中的可溶性固形物不断增加,说明随时间增加原料中水溶性成分会不断溶出.当将提取时间增加至 4 h 以上时,料液中可溶性固形物会逐步稳定,这可能是一段时间后,水溶性物质已基本溶出且部分活性成分有所损失,故而料液中的可溶性固形物含量不再增加[19].

2.1.4 pH对沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影响

由图4可知,料液中pH值在8以下时,料液中的可溶性固形物不断增加,当将pH值增加至9时,料液中可溶性固形物略有下降,这可能是由于过碱环境不利于茶多酚等物质溶出,故而导致料液中的可溶性固形物含量有所下降[19].

图3 水提时间对沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影响

图4 pH对沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影响

2.2 响应面优化分析

2.2.1 响应面实验结果

在单因素的基础上,选取料液比(A)、水提温度(B)、水提时间(C)、pH(D) 4个因素为变量,以沙棘普洱茶料液中可溶性固形物为响应值,采用Design-Expert 8.0.6统计软件进行4因素3水平试验.实验设计及结果如表2所示.

采用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行二次多元回归分析,对自变量A、B、C、D和可溶性固形物进行多元二项式方程拟合.回归方程,如下：

Y=-64.804 17-2.483 33×A+0.58×B+2.508 33×C+9.275 00×D+(5.000 00E-003)×A×B+0.025×A×C+0.2A×D-(5.000 00E+003)×B×C+0.025 000×B×D+0.125 00×C×D-0.420 83×A2-(5.083 33E+003)×B2-0.583 33×C2-0.620 83×D2

表2 响应面实验设计及结果

2.2.2 响应面方差分析

对回归方程进行方差分析,结果见表3.回归方程显著性检验P<0.05,表明模型具有显著性;失拟项P=0.826 0>0.05,表明方程拟合程度较高,无明显失拟存在,此模型成立[20].

可溶性固形物的响应面图见图5～10,响应面图可以直观地反映各因素间的交互作用及各因素与响应值间的关系.响应面坡度越陡表示两因素交互作用越大,反之则表示两因素交互作用不显著.等高线呈圆形表示两因素之间交互作用不显著,呈椭圆形或马鞍形则表示两因素之间交互作用显著[20].

表3 方差分析结果

续表3

(A) (B)图5 提取温度和料液比的响应面(A)和等高线图(B)

(A) (B)图6 提取时间和料液比的响应面(A)和等高线图(B)

(A) (B)图7 pH和料液比的响应面(A)和等高线图(B)

(A) (B)图8 提取时间和提取温度的响应面(A)和等高线图(B)

(A) (B)图9 提取温度和pH的响应面(A)和等高线图(B)

(A) (B)图10 pH和提取时间的响应面(A)和等高线图(B)

经软件分析,沙棘普洱茶粉的最佳工艺是：料液比为1∶8(g/mL),提取温度为 78.4 ℃,提取时间为 2.8 h,pH为8.3,预测可溶性固形物为4.9%.为了便于控制实验条件,将最佳工艺调整为料液比为1∶8(g/mL)、提取温度为 79 ℃,提取时间为 3 h,底物pH为8.3.应此条件进行3次平行试验,平均可溶性固形物含量为4.8%±0.1%(RSD<2%),与预测值接近,说明该模型可用于拟合分析,结果稳定可靠,也与其他研究的相关提取参数一致[13,21].

2.3 不原料配比下沙棘普洱茶粉活性成分检测及体外抗氧化实验结果

2.3.1 不同原料配比下沙棘普洱茶粉活性成分检测

由表4所示,5种配比的沙棘普洱茶粉均含有相关活性物质,其中普洱茶粉中各成分含量较高,沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)为3种混合茶粉中活性成分含量最高的,此外沙棘茶粉中沙棘总黄酮含量相对较高.

表4 样品理化指标检测 (mg/100g)

2.3.2 DPPH自由基清除能力测定

由图11所示,在相同活性成分浓度含量、反应时间条件下,沙棘茶粉与沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)的DPPH自由基清除能力最强,普洱茶粉和沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)均有较强的清除能力,沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶1)最弱,且均有剂量依赖性.其中,沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉的IC50(半清除率浓度)均在 1.0 mg/mL 以下.45 min 时,3.5 mg/mL 的不同溶液对DPPH自由基清除能力为：Vc>沙棘茶粉>普洱茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)>沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)>沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶1).

(A)浓度测试 (B)反应时长测试图11 DPPH抗氧化试验

2.3.3 ABTS自由基清除能力测定

由图12所示,在测定范围内,沙棘茶粉与沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)的ABTS自由基清除能力最强,普洱茶粉与沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)对ABTS的清除能力基本一致,而沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶1)清除能力相对较弱,所有测试成分均具有剂量依赖性,而所有茶粉的IC50均在 1.0 mg/mL 以下.40 min 时,3.5 mg/mL 的不同活性成分溶液对ABTS自由基清除能力为：Vc>沙棘茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)>普洱茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)>沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶1).

(A)浓度测试 (B)反应时长测试图12 ABTS抗氧化试验

2.3.4 FRAP抗氧化能力测定

由图13可知,普洱茶粉、沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)对FRAP铁离子均有较强的还原能力,而沙棘茶粉则相对较弱.

2.3.5 CuPRAC抗氧化能力测定

由图14可知,从清除率来看,沙棘普洱茶粉(1∶4)对Cu2+离子的还原能力最强,普洱茶粉次之,沙棘普洱茶粉(4∶1)也有较强还原能力,而沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉(1∶1)还原能力相对较弱,且均呈现剂量依赖性.

图13 FRAP抗氧化试验(浓度测试)

图14 CuPRAC抗氧化试验(浓度测试)

3 讨论与结论

研究表明,沙棘叶中富含黄酮类、多酚等营养成分,是开发成功能性食品、药品、保健食品等的潜在原材料,此外,通过充分利用沙棘叶,不但可以利用废弃资源,还可以提高人们健康水平,进而产生巨大的经济价值[22].经研究表明,沙棘叶水溶提取物对羟基自由基及超氧阴离子自由基均有较强的清除能力,其清除率达到80%以上[2],进一步验证了沙棘叶中存在抗氧化能力较强的生物活性物质.普洱茶因其在陈化过程中其品质型理化指标,如茶多酚、茶色素、多糖、氨基酸等均会发生变化[23],而香气组分会发生富集,从而使其更具饮用价值[24].利用其所制作的普洱茶粉能够显著提高高血脂症大鼠肝组织细胞中GSH-Px酶、SOD酶活力及降低MDA含量,从而起到降低血脂的作用,其抗氧化性明显高于六堡茶和黑茶粉[15].

本研究基于单因素实验、响应面优化实验,讨论沙棘普洱茶浸提过程中的关键工艺条件,得到了最优工艺参数.此外,通过使用体外抗氧化实验的方法对不同原料沙棘叶与普洱茶末配比下所制备的茶粉进行对比实验,实验发现沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)、沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)相对于普洱茶粉、沙棘茶粉均具有较强的综合体外抗氧化活性,而相关理化检测结果显示其所含活性成分也相对较高,说明通过沙棘叶与普洱茶的复配,其茶粉内活性成分富集,具有更强的抗氧化活性,更有益于人体健康[25].

本研究通过单因素实验及响应面法设计优化了沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)水提的最佳工艺条件,结果表明,沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)的最佳工艺条件为：料液比为1∶8(g/mL)、提取温度为 79 ℃,提取时间为 3 h,底物pH为8.3.应用此条件进行3次平行试验,平均可溶性固形物达到4.8%.此外,通过对不同配料比的沙棘普洱茶粉进行体外抗氧化实验,发现沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=4∶1)对ABTS、DPPH的清除能力最强,普洱茶粉的总抗氧化能力最强,沙棘普洱茶粉(沙棘叶∶普洱茶末=1∶4)对Cu2+的还原能力最强.此外,理化指标检测显示沙棘普洱茶粉相对于单一茶粉所含相关活性成分(茶多酚、茶褐素及总黄酮)更均衡,进一步说明沙棘普洱茶粉可以富集相关活性成分,提高体外抗氧化能力.由此,经过对沙棘普洱茶粉水提工艺及抗氧化能力进行研究,可以为其进一步综合利用沙棘、普洱资源进而开发功能性茶粉提供了一定的科学依据.