沉香叶的镇痛抗炎作用研究

王三炜,谢言青,金 叶,周志宏,刘 录

(云南中医药大学 云南云中营养与健康研究院,云南 昆明 650500)

《中国药典》中记载,沉香为瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有树脂的木材,具有温中止呕,纳气平喘,行气止痛的功效,多用于胃寒呕吐呃逆,胸腹胀闷疼痛,肾虚气逆喘急[1].沉香叶可一年采收两季,已有研究表明沉香叶也具有抗炎、镇痛、镇静、促进肠推进等生物活性[2],被广泛用于中医治疗中.市面上也有许多与沉香叶相关的保健茶：沉香叶肾茶,沉香叶保健品等.

据文献[3-4]报道沉香叶提取物具有显著的抗炎镇痛活性,但研究不够深入,所以本实验通过痛刺激(热板法、醋酸扭体)模型和小鼠耳廓肿胀抗炎模型综合评价沉香叶醇提物的抗炎镇痛效果,并且初步探讨沉香叶镇痛抗炎的作用机制,为沉香叶的临床应用提供理论基础,为沉香叶的产品开发奠定了基础.

1 材料

沉香叶由云南中医药大学杨竹雅教授鉴定为瑞香科沉香属的白木香 (Aquilariasinensis(Lour.)Gilg)的叶;另取沉香叶粉末 550 g,用12倍量(6 600 mL)的75%乙醇回流提取3次,每次 2 h,合并提取液、减压蒸馏、真空干燥得到沉香叶醇提物粉末,加生理盐水配制成低(0.2 g 生药/mL)、中 (0.4 g 生药/mL)、高剂量 (0.8 g 生药/mL).

购买斯贝福(北京)生物科技有限公司提供的SPF昆明级小鼠180只,体重18～22 g,雌雄各半,实验动物生产许可证号SCXK(京)2019-0010;饲养于云南中医药大学动物中心,使用普通小鼠饲料喂养,自由饮水,温度20～25 ℃,湿度40%～70%.

热板仪(成都泰盟科技有限公司);电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);超纯水(成都优谱,UPTL-1-20T);氯化钠注射液(双鹤药业批号：210630);双氯芬酸钠(Macklin生产,批号：D829756,纯度≥99.0%);冰醋酸(风船化学试剂有限公司,批号：20110103);二甲苯(天津化学公司,批号：20080613).小鼠体内药理实验所用到的试剂盒：小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)/48T、小鼠白细胞介素10(IL-10)/48T、小鼠白细胞介素4(IL-4)/48T、小鼠白细胞介素1β(IL-1β)/48T、小鼠前列腺素E2(PGE2)/48T、小鼠β-内啡肽(β-EP)/48T、小鼠缓激肽(BK)/48T均为江苏酶免实业有限公司.

2 实验方法

2.1 观察沉香叶醇提物对小鼠耳肿胀的影响

取体重18～22 g 的健康小鼠50只,雌雄各25只,随机分组为5组(模型对照组M、阳性对照组Y和沉香叶醇提物低 D、中Z、高剂量组G)每组10只.按模型对照组M(生理盐水)、沉香叶醇提物低D、中Z、高剂量组G、阳性组(双氯芬酸钠/Y)灌胃给药(体积为 10 mL/kg).末次给药 1 h 后,给每只小鼠右耳的正反两面涂抹二甲苯约 20 μL 致炎,左耳作为空白对照,致炎15～20 min 后拖颈处死,用直径 8 mm 打孔器剪下左右两圆耳,分别称重.

左右耳重量之差即为肿胀度.将每组取下的右耳放入EP管中,用ELISA法检测制备的组织匀浆上清液中的 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4 含量.

2.2 观察沉香叶醇提物对小鼠醋酸扭体的影响

按上述方法与剂量分组、适应给药、饲养,于末次给药后 1 h,腹腔注射0.6%冰醋酸生理盐水(10 mL/kg).注射醋酸后观察记录 20 min 内小鼠扭体次数,并计算抑制率[(空白组扭体次数-给药组扭体次数)/空白组扭体次数×100%].

扭体反应观察结束后迅速摘取小鼠眼球取血,分离血清,用ELISA法检测小鼠血清中PGE2、β-EP、BK的含量.

2.3 观察沉香叶醇提物对小鼠热板的影响

在(50～55)℃的热板预选出痛阈值在10～25 s 的雌性小鼠50只,间隔 10 min 重新测定1次,取2次平均痛阈值作为给药前小鼠的痛阈值.按上述方法与剂量分组、适应给药、饲养,于末次给药后测定0.5、1、1.5、2和 2.5 h 的痛阈,记录并比较各组结果.

3 实验结果

3.1 沉香叶醇提物对小鼠耳廓肿胀的影响

见表2及图1,各组涂抹二甲苯之后均会出现红肿,其中沉香叶醇提物低剂量组(D)、中剂量组(Z)、高剂量组(G)与模型组(M)相比小鼠耳肿胀程度可见明显减轻,其肿胀度具有统计学意义(P<0.05).

表2 沉香叶醇提物对小鼠二甲苯耳廓肿胀的影响

图1 小鼠耳廓肿胀度

表3及图2、3、4、5示,沉香叶醇提物中剂量组(Z)、高剂量组(G)与模型组(M)相比较均能降低小鼠耳组织中炎症因子TNF-α、IL-1β的含量,能提高IL-10、IL-4的含量,其中除沉香叶低剂量组(D)与模型组(M)相比,小鼠耳组织中TNF-α的含量差异无统计学意义外,其余所有含量差异具有统计学意义(P<0.05).

表3 沉香叶醇提物对小鼠耳组织中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4的含量

图2 小鼠耳组织中TNF-α含量

图3 小鼠耳组织中IL-1β含量

图4 小鼠耳组织中IL-4含量

图5 小鼠耳组织中IL-10含量

3.2 沉香叶醇提物对小鼠醋酸扭体的影响

0.6%冰醋酸生理盐水经腹腔注射后,沉香叶醇提物低剂量组(D)、中剂量组(Z)、高剂量组(G)与模型组(M)相比出现扭体反应的时间有一定的延长,且扭体次数也随着剂量增加而减少,高剂量组的扭体抑制率可达到61.32%.见表3及图6.

表3 沉香叶醇提物对小鼠醋酸致痛扭体的影响

图6 小鼠醋酸扭体致痛反应

表4及图7、8、9示,沉香叶醇提物低剂量组(D)、中剂量组(Z)、高剂量组(G)与模型组(M)相比能降低小鼠血清中PGE2和BK含量和提高β-EP含量,差异具有统计学意义(P<0.05).

表4 沉香叶醇提物对小鼠扭体血清中PGE2、β-EP、BK的含量

图7 小鼠血清中PGE2的含量

图8 小鼠血清中β-EP的含量

图9 小鼠血清中BK的含量

3.3 沉香叶醇提物对小鼠热板的影响

表5及图10、11、12、13、14示,沉香叶醇提物低剂量组(D)与模型组(M)比较在 2 h 以前无显著性差异.沉香叶醇提物中剂量组(Z)、高剂量组(G)都在给药 1 h 后痛阈值提高,与模型组(M)相比具有统计学意义(P<0.01).

表5 沉香叶醇提物对小鼠热板痛阈的影响

图10 小鼠热板致痛30 min反应

图11 小鼠热板致痛60min反应

图12 小鼠热板致痛90 min反应

图13 小鼠热板致痛120 min反应

图14 小鼠热板致痛150 min反应

4 结语

本实验利用经典痛刺激(热板法、醋酸扭体)模型和小鼠耳廓肿胀抗炎模型,通过体内实验对沉香叶的抗炎镇痛活性进行研究.通过二甲苯致小鼠耳肿胀抗炎模型表明沉香叶醇提物中剂量、高剂量组具有抗炎作用,与模型对照组比,沉香叶醇提物低、中、高剂量对小鼠耳肿胀具有抑制作用,可不同程度的减少小鼠耳组织中的小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)和小鼠白细胞介素1β(IL-β)的含量(P<0.05),提高小鼠白细胞介素4(IL-4)和小鼠白细胞介素10(IL-10)的含量(P<0.05),推测其作用机制是通过抑制耳组织中的致炎因子TNF-α、IL-1β的生成和通过提高抗炎因子IL-10、IL-4的含量来抑制炎症的发生,说明沉香叶是通过正负反馈双向调节起到抗炎作用的[5-6].通过醋酸扭体模型和热板模型实验表明,沉香叶醇提物具有一定的镇痛作用,低、中、高剂量均能抑制小鼠扭体次数,通过小鼠血清中研究发现,沉香叶醇提物各剂量组能降低醋酸扭体小鼠的扭体次数和血清中小鼠前列腺素E2(PGE2)和小鼠缓激肽(BK)的含量(P<0.05),也均能提高小鼠血清中小鼠β-内啡肽(β-EP)的含量,结果表明其镇痛作用机制可能与抑制血清中的致痛物质PGE2、BK的含量和促进镇痛物质β-EP的释放有关[7].