抗蜜蜂病毒天然产物的初步筛选研究

黄知楚,周倪红,刘 瑶,郑火青

(浙江大学 动物科学学院,浙江 杭州 310058)

蜜蜂是重要的经济昆虫,约三分之一的农作物依赖于蜜蜂授粉,其授粉服务使农作物增值约9.5%[1]。尽管世界粮农组织统计数据(https：//www.fao.org/faostat/en/#data/QCL)表明,自2000年来全球蜂群总数增长了45%,但其提供的蜂产品和授粉服务仍不能满足日益增长的世界人口数量和粮食产量需求[2]。而近十多年来大量的蜂群损失不仅加重了养蜂成本,也给如何满足这些需求带来了更大的挑战。在影响蜜蜂健康的众多因素中,蜜蜂病毒不仅广泛分布,还因多呈隐性感染而在养蜂生产中被忽视[3-4]。以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)是蜂群中最常见的病毒之一,能够侵染各生长阶段和各级型蜜蜂,患病蜜蜂失去飞行能力,伴随翅震颤麻痹症状快速死亡,从而造成蜂群的大量损失[5-6]。

蜜蜂病毒病的防治是养蜂生产中的一个难题。由于在蜂群中使用农用化合物会给蜂产品质量安全带来风险,研发绿色无污染的天然产物补充剂用于蜂群疾病防控有重要意义。多项研究表明,给蜜蜂补充天然产物补充剂能够增强蜜蜂抗病毒能力,降低蜜蜂体内病毒水平。如Palmer-Young等[7]研究表明,包括苦杏仁苷、桃叶珊瑚苷等在内的7种天然产物都表现出对蜜蜂健康有益的方面,其中百里酚、梓醇和尼古丁显著降低了蜜蜂残翅病毒(deformed wing virus, DWV)的感染水平,上调了Imd和Toll通路调控的抗菌肽基因表达。Hsieh等[8]发现,感染IAPV的蜜蜂摄入自然浓度的咖啡因可以显著提高其存活率。Sun等[9]的结果表明,板蓝根提取物可以抑制蜜蜂囊状幼虫病毒(sacbrood virus, SBV)复制,调节免疫应答。

本研究在前人研究基础上,根据文献报道选取了百里酚、青蒿素、梓醇、胡椒碱、可可碱、苦杏仁苷、咖啡酸、橙皮苷和ρ-香豆酸等9种可能对蜜蜂抗病毒有促进作用的天然产物,并基于IAPV感染性强、发病症状显著且分离纯化方法成熟的优点,将其作为一种有价值的模型病毒感染蜜蜂,对预选天然产物进行筛选和验证,同时分析有效天然产物对蜜蜂免疫相关基因表达的影响,以期为养蜂生产上蜜蜂病毒病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所有供试的西方蜜蜂均取自浙江大学紫金港校区实验蜂场。

9种天然产物化学品均购自上海麦克林生化科技有限公司(表1);超纯总RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司;反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自TaKaRa Bio公司。

表1 天然产物来源与试验浓度

试验仪器主要有全自动样品快速研磨仪(上海净信科技有限公司)、高速冷冻离心机(Eppendorf Centrifuge 5424R)、荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)、恒温培养箱(宁波赛福实验仪器有限公司)等。

1.2 以色列急性麻痹病毒(IAPV)液的制备与纯化

参照Mullapudi等[17]的研究方法,首先制备以IAPV为主的病毒液,然后利用IAPV在工蜂蛹优势扩增的原理,将病毒液注射入白眼阶段蜂蛹,恒温恒湿培养箱(34～35 ℃,相对湿度75%～90%)中培养5 d后纯化,获得较纯的IAPV病毒液。

1.3 天然产物抗病毒作用初步筛选

选取群势6框(朗氏标准框)以上、无可见疾病症状、未检出常见蜜蜂病毒感染的蜂群。取临出房子脾置于恒温恒湿培养箱(34～35 ℃,相对湿度75%～90%),蜜蜂出房后统一收集于笼养试验盒中,每盒饲养50只蜜蜂。

蜜蜂收集完毕后先进行2～4 h的饥饿处理,再饲喂含IAPV病毒的蔗糖溶液48 h。溶液配制方法如下：纯化后的IAPV病毒液先在磷酸缓冲液(PBS)中梯度稀释,最后一次稀释至50%蔗糖溶液中,获得IAPV浓度为0.8×108copies·μL-1的蔗糖溶液。饲喂期间每12 h更换一次新配制的蔗糖溶液以保证病毒效力。

处理48 h后所有蜜蜂进行随机分组,每组设置3个重复。对照组设空白对照组(BC,仅饲喂蔗糖溶液)和阴性对照组(NC,饲喂含2%乙醇的蔗糖溶液)。试验的9种天然产物参考对应文献分别设置了高、低两种浓度(表1),溶液配制时使用无水乙醇作为助溶剂。各处理组随机饲喂含一种天然产物一种浓度的蔗糖溶液。在第7天时收集每个处理组样本,测定蜜蜂体内IAPV的病毒载量,初步筛选出具有抗蜜蜂病毒效果的天然产物。

1.4 有效天然产物抗病毒作用验证

为进一步验证筛选出可能有效的几种天然产物的效果,我们另外选取自然携带有多种病毒的蜂群,收集蜂群条件下的成年工蜂,在实验室条件下研究这些天然产物对蜜蜂抵抗这些携带的蜜蜂病毒的作用。

选取群势较弱的蜂群,检测蜂群中常见蜜蜂病毒的感染情况,选取携带有IAPV、黑蜂王台病毒(black queen cell virus, BQCV)、SBV这3种蜜蜂病毒的蜂群用于实验。将巢脾上的蜜蜂抖落到收集箱中,在实验室内用CO2麻醉蜜蜂(30 s至1 min)并将其计数到笼养试验盒中。每盒饲养50只蜜蜂,每组设置3个重复。随机分组后给蜜蜂饲喂可能有效的天然产物,在第7天时收样检测蜜蜂体内各流行病毒载量。

1.5 有效天然产物对蜜蜂免疫基因表达的影响

再次选取健康的新出房工蜂定量感染IAPV病毒,蜜蜂的收集和接种方法重复1.3节步骤,处理48 h后更换为含有效天然产物的蔗糖溶液。在第7天时收样检测蜜蜂体内免疫相关基因的表达情况。

1.6 病毒绝对定量与免疫基因相对定量

总RNA提取参照北京艾德莱生物科技有限公司超纯总RNA快速提取试剂盒说明书步骤进行。反转录反应参照TaKaRa Bio公司反转录试剂盒说明书步骤进行。对IAPV、BQCV、SBV等病毒进行绝对定量。建立各病毒定量的标准曲线,通过标准曲线和每个样本对应的CT值计算目标病毒的基因组拷贝数。反应体系共10 μL,其中cDNA模板1 μL,上游和下游引物各0.5 μL(引物序列见表2),TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)5 μL以及RNase free water 3 μL,以H2O替代cDNA为空白对照。RT-PCR扩增程序为：95 ℃,1 min;40个循环反应：95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min;熔解曲线：95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。

表2 病毒绝对定量引物序列

各病毒的标准曲线如下：YIAPV=-3.1444X+38.929,R2=0.985 9;YBQCV=-3.83X+47.487,R2=0.994 6;YSBV=-3.4718X+43.739,R2=0.998 6(Y代表CT值,X代表病毒的lg拷贝数,病毒拷贝数为10Xcopies)。

对卵黄蛋白原基因vitellogenin(Vg),抗菌肽基因hymenoptaecin、abaecin、defensin,RANi通路关键基因dicer以及热休克蛋白基因protein lethal (2)essential for life-like(pl2)、heat shock 70-ku protein cognate(hsc70)、heat shock protein 90 (hsp90)等8个免疫基因进行相对定量。反应体系与反应程序参照病毒绝对定量(引物序列见表3),以β-actin作为内参基因,采用2-△△CT法分析各基因相对定量结果。

表3 免疫基因相对定量引物序列

2 结果与分析

2.1 定量接种外源IAPV病毒液条件下天然产物抗病毒作用

定量接种外源IAPV病毒液后,饲喂糖水的空白组(BC)和饲喂糖水加乙醇的阴性对照组(NC)间病毒基因组拷贝数没有显著差异(tBC=6.233,tNC=6.160;P=0.547)。由图1可知,9种物质中,有4种物质(百里酚、梓醇、胡椒碱、橙皮苷)在至少一个浓度下有一定的抗病毒作用趋势,其中,与对照组相比,10 μmol·L-1百里酚组IAPV病毒基因组拷贝数显著更低(t=5.596,P=0.012),IAPV的病毒载量下降了46.89%。

*表示差异显著(P<0.05)。下同。* indicates the significant difference (P<0.05).The same as below.图1 九种天然产物对定量接种蜜蜂病毒IAPV的作用效果Fig.1 Effects of 9 natural products on exogenous honeybee virus IAPV

2.2 蜜蜂携带病毒条件下天然产物抗病毒作用

实验所用的蜂群主要携带BQCV、IAPV和SBV这3种蜜蜂病毒(图2-A),在实验室条件下笼养7 d后,IAPV病毒载量极显著升高(t0d=4.592,t7d=7.161,P<0.01)。

对百里酚、梓醇、胡椒碱和橙皮苷这4种物质的抗病毒作用进行进一步研究。4种天然产物对蜂群中BQCV、IAPV和SBV这3种病毒作用效果如下图所示,仅有10 μmol·L-1百里酚表现出对IAPV(t=6.403,P<0.05,图3-A)和SBV(t=6.520,P<0.05,图3-C)显著降低的作用效果,IAPV和SBV的病毒载量分别下降了82.55%和86.31%。

A,对IAPV作用效果;B,对BQCV作用效果;C,对SBV作用效果。A, Effect on IAPV; B, Effect on BQCV; C, Effect on SBV.图3 四种天然产物对蜜蜂多种病毒的作用效果Fig.3 Effect of 4 natural products on various viruses of honeybee

2.3 百里酚对蜜蜂免疫相关基因表达的影响

由图4可知,蜜蜂免疫相关基因Vg表达相较对照组显著(P<0.01)提高了12.169倍,蜜蜂抗菌肽基因hymenoptaecin、defensin以及热休克蛋白hsp90有升高趋势(P>0.05)。

图4 百里酚对蜜蜂免疫相关基因相对表达量影响Fig.4 Effects of thymol on the immune response of honeybees

3 讨论

天然产物,也称次级代谢产物,是指动物、植物或微生物等天然来源的具有药理学或生物学活性的化合物或其代谢产物[30]。天然产物独特的理化结构赋予其抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎等特性,因而在医药、农业、食品、能源等多领域都有着广泛的应用前景。

天然产物的抗病毒作用主要通过两种途径发挥作用,一是特异性抑制病毒的复制进程,二是通过增强免疫系统使机体更有效地对抗病毒。养蜂生产中,蜂群往往同时感染多种病毒,因此在获得特异性抗蜜蜂病毒药物难度较大的情况下,通过综合性的方法筛选能提高蜜蜂抗病毒能力的天然产物是比较可行的一个途径。

本研究筛选的9种天然产物中,百里酚饲喂蜜蜂后表现出了明显的促进抗病毒作用。在外源接种IAPV的条件下,10 μmol·L-1百里酚饲喂7 d后,相对于对照组病毒载量下降了46.89%。蜜蜂抗病性相关实验结果常因实验条件的改变而有不同。因此,我们在本研究中,选用携带多种病毒的蜜蜂进行进一步的筛选验证,表明10 μmol·L-1百里酚使IAPV、SBV病毒载量分别下降了82.55%、86.31%,验证了其显著的抗蜜蜂病毒作用。免疫基因表达量检测结果表明,10 μmol·L-1百里酚使蜜蜂免疫基因Vg的表达提高了12.169倍。Vg基因几乎存在于所有卵生动物中,昆虫Vg通常在繁殖雌性的脂肪体细胞中表达,作为卵黄蛋白的前体为胚胎发育提供营养物质[31]。然而,Vg在蜜蜂种群中进化出了非产卵功能,该基因不仅由具有繁殖功能的蜂王表达,也在雄蜂和不育工蜂中有表达[32-34],其功能包括但不限于参与免疫、营养、抗应激、行为发育、衰老、氧化应激和长寿等[35-37],因此,Vg是蜜蜂健康水平的重要指标。这些结果表明,百里酚对蜜蜂健康有很大的促进作用,并进而提升蜜蜂的抗病毒能力。

百里酚,学名5-甲基-2-异丙基苯酚,是从唇形科、马鞭草科、玄参科等植物精油中发现的主要单萜酚成分[38]。百里酚很早就被应用于传统医学,并被证明具有抗炎、抗氧化等多种药理活性[39],在蜜蜂抗病研究中也早有涉及。Wiese等[40]发现,植物花蜜或花粉中的百里酚成分具有抑菌作用,蜜蜂会主动采集这些物质加强蜂群的社会防御。Glavinic等[11]证明了摄入百里酚有利于增加感染微孢子虫的蜜蜂的存活率、免疫力和抗氧化保护,但其并不适用于微孢子虫的预防。Palmer-Young等[41]发现,丁香酚与百里酚可以协同作用抑制熊蜂寄生虫短膜虫的生长。这些研究结论结合本研究的结果说明,百里酚在蜜蜂健康养殖中很有应用前景,值得进行深入开发。