γ-氨基丁酸对怀玉山三叶青低温胁迫下试管苗生长及相关生理代谢的影响

洪森荣，余锾媛，彭睿羚，刘雯莉，胡藤鑫，王玉婷（.上饶师范学院生命科学学院，江西 上饶 33400；2.上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 33400；3.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室，江西 上饶 33400；4.上饶市三叶青保育与利用技术创新中心，江西 上饶 33400）

三叶青（TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg）为葡萄科（Vitaceae）崖爬藤属（Tetrastigma）植物，学名三叶崖爬藤，味苦、辛，性平或凉，归心、肺、肝、肾经，以块根或全草入药，有“植物抗生素”“抗癌神草”等美誉，为民间珍稀中草药[1]，始载于清代植物学专家吴其濬的《植物名实图考》。三叶青常用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调、咽痛、瘰疬等症，具有抗炎镇痛、抗肝损伤、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等作用，临床上多用于各种炎症、病毒感染和癌症的治疗[2]。怀玉山三叶青主要分布在以怀玉山山脉为中心的赣、浙、皖、闽相交的高山山区，其茎叶含有牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素和牡荆素等抗癌活性成分，块根的黄酮类成分有山奈酚芸香糖苷、芦丁、异槲皮苷、儿茶素、紫云英苷等[3]。怀玉山三叶青具有抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡等作用，可作为癌症防治的功能性食品[4-8]。2016 年3 月31 日，原中华人民共和国农业部正式批准对“怀玉山三叶青”实施农产品地理标志登记保护[9]。随着怀玉山三叶青用途和应用领域的扩大，由于过度采挖导致怀玉山三叶青野生资源蕴藏量急剧下降，面临枯竭[10]。2018 年3 月，怀玉山三叶青被江西省森林药材与食品研究所推荐为“适宜林下套种栽培的中药材品种”[11]。在低产经济林或毛竹林下套种怀玉山三叶青，既可以充分利用生态资源，发展林下经济；同时对于发展绿色无公害药用植物种植、促进生态农业可持续发展具有重要意义。但有研究[11]表明，在海拔800 m 以上区域的怀玉山三叶青，冬季地上部分会冻坏，甚至整株死亡，且越往海拔高的地方，植株冻死的比例越大。如何抗低温胁迫是怀玉山三叶青仿野生栽培需要迫切需要解决的问题。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种四碳非蛋白质氨基酸的植物分子信号[12]，可调节细胞内外环境酸碱度，维持碳氮营养平衡，参与植物对逆境胁迫的响应[13-14]。已有研究证实，外源GABA 处理能减轻桃[15-16]、香蕉[17]和苹果[18]等果实采后低温冷害的发生，增强油菜[19]、粳稻[20]和黄瓜[21]等幼苗的低温抗性。本研究以怀玉山三叶青2 个栽培种“怀玉1 号”和“怀玉2 号”试管苗为材料，观察继代培养时培养基中添加GABA对低温胁迫下试管苗生长及相关生理代谢的影响，以明确GABA在怀玉山三叶青组织培养中的作用，为怀玉山三叶青试管苗的高效、高质量繁育提供技术指导，并为GABA在怀玉山三叶青仿野生栽培中的防冻抗寒应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料怀玉山三叶青2 个栽培种“怀玉1 号”和“怀玉2 号”试管苗由上饶市三叶青保育与利用技术创新中心提供，经上饶市红日农业开发有限公司陈荣华高级农艺师鉴定为葡萄科（Vitaceae）崖爬藤属（Tetrastigma）植物三叶青（TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg）。

1.2 方法

1.2.1 怀玉山三叶青试管苗生长指标的测定 取继代培养的试管苗，切取其1.5 cm 的带芽茎段，转接到添加了GABA 的培养基上。培养基设置为基本培养基（MS）+1 mg·L-16-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg·L-1萘乙酸（NAA）+0～0.7 g·L-1GABA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂（pH 5.8）[22]。每种培养基设置为3 次重复，每次重复接种25 个茎段，放入光照培养箱培养。光照培养箱的培养条件为：光照强度30～40 μmol·m-2·s-1，光照时间14 h·d-1，温度（5±1）°C。培养2 个月后，测定2 个试管苗的增殖系数（MC）（增殖系数=新增芽数/接种茎段数）、株高（PH，cm）、鲜质量（FM，mg）和干质量（DM，mg），并计算试管苗的组织含水量（TWC，%）[（鲜质量-干质量）/鲜质量×100%][22]。

1.2.2 怀玉山三叶青试管苗生理指标的测定 根据“1.2.1”项下实验结果，筛选有效促进低温试管苗生长的较佳GABA 浓度，以此浓度GABA 处理的试管苗为处理组，以蒸馏水（即0 g·L-1GABA）处理的试管苗为对照组，处理组和对照组均置于低温（5±1）°C 下进行培养试验。培养至60 d 时分别取试管苗测定相关生理指标。内源激素[吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR）、赤霉素3（GA3）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）]的含量采用岛津超高效液相色谱仪（LC-30AT）连接SCIEX 5600+质谱仪测定[23]；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定[24]；可溶性糖（SS）含量采用蒽酮比色法测定[25]；脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮比色法测定[26]；可溶性蛋白（SP）含量采用考马斯亮蓝G-520 法[25]测定；超氧阴离子（O2·-）产生速率采用羟胺氧化法[27]测定；过氧化氢（H2O2）含量采用H2O2试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定；还原型谷胱甘肽（GSH）含量采用HPLC 法[28]测定；抗坏血酸（AsA）含量采用Kampfenkel 等[29]的Fe3+还原法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑光还原法[30]测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚比色法[31]测定；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性采用黄真池等[32]的方法测定；谷胱甘肽还原酶（GR）活性采用李慧等[33]的方法测定。所有指标均重复3次。

1.2.3 怀玉山三叶青试管苗查尔酮合酶和黄酮醇合酶基因的实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测按“1.2.2”项下方法分组及培养三叶青试管苗。培养至60 d 时依据植物RNA 提取试剂盒（Omega）说明书分别提取怀玉1 号和怀玉2 号试管苗的总RNA。参考林国卫等[34]的方法，验证总RNA 的完整性、含量和纯度。采用SuperRT cDNA 第一链合成试剂盒（CWBIO），按照说明书要求合成反转录cDNA 第一链。参考本实验室[35]的方法，设计基因引物。查尔酮合酶（CHS）基因的引物为：（正向引物F）5’CACGAG TCCCACCTCGACTC3’；（反向引物R）5’AGGGGACG CTCCACGGACA3’，黄酮醇合酶（FLS）基因的引物为：（F）5’ATATGTACCCACCATGCCCACA3’；（R）5’CGGCGATCCAGTTATCGTCTT3’，以GAPDH 为内参基因，进行qRT-PCR检测。

1.2.4 数据统计与分析 采用Microsoft Excel 2010 录入、整理和统计数据，结果数据用“均数±标准差”表示。运用SPSS 24.0 统计软件进行分析，采用LSD法进行数据间的多重比较，并运用Duncan’s 法进行差异显著性检验和Pearson 相关性分析。采用Microsoft Excel 2010进行绘图。

2 结果与分析

2.1 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗生长和组织含水量的影响GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗增殖倍数、株高、鲜质量及干质量的影响见表1。添加不同浓度的GABA（0.1～0.7 g·L-1）可以显著促进低温胁迫下试管苗增殖系数、株高、鲜质量及干质量的增加。其中，0.5 g·L-1GABA 的促进效应最好。与未添加GABA 的对照组相比，0.5g·L-1GABA 处理组试管苗的增殖系数、株高、鲜质量及干质量均达到最高值。与对照组比较，怀玉1号和怀玉2号试管苗的增殖系数分别增加1.77、1.89 倍，株高分别增加2.96、3.38 倍，鲜质量分别增加1.88、2.28 倍，干质量分别增加2.33、3.39 倍。不同浓度（0.1～0.7 g·L-1）的GABA 可以显著增加低温胁迫下怀玉1 号和怀玉2 号试管苗组织含水量。与对照组相比，0.5 g·L-1GABA 处理组怀玉1 号和怀玉2 号试管苗组织含水量均达到最高值，分别是对照组的1.08 倍和1.10倍。

表1 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗生长和组织含水量的影响（±s）Table 1 Effects of GABA on the growth and tissue water content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

表1 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗生长和组织含水量的影响（±s）Table 1 Effects of GABA on the growth and tissue water content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

注：相同指标不同小写字母表示两组间差异有显著性（P＜0.05）

GABA 浓度/（g·L-1）0 0.1 0.3 0.5 0.7增殖系数怀玉1 号1.8±0.2c 2.1±0.4c 2.8±0.3b 3.2±0.6a 2.2±0.5c怀玉2 号77.0±8.2d 81.7±4.3c 82.8±6.2b 85.1±3.9a 83.5±5.9b怀玉2 号1.9±0.6c 2.2±0.5b 3.5±0.3a 3.6±0.5a 2.3±0.8b株高/cm怀玉1 号2.3±0.3e 3.4±0.8d 5.2±1.2b 6.8±0.9a 4.5±0.7c怀玉2 号2.6±0.5d 4.6±0.3c 6.5±0.7b 8.8±0.4a 6.8±0.3b鲜质量/mg怀玉1 号36.3±4.2e 41.6±6.2d 57.3±3.5b 70.4±8.8a 50.3±5.2c怀玉2 号38.7±6.5d 58.3±7.3c 76.6±4.5b 86.4±3.8a 74.5±2.9b干质量/mg怀玉1 号8.7±1.2c 8.6±2.5c 10.3±1.1b 12.6±3.2a 9.9±2.8b怀玉2 号8.9±2.1c 10.7±1.8b 12.8±2.2a 12.9±3.1a 12.3±2.4a组织含水量/%怀玉1 号76.3±5.6c 79.3±4.9b 82.2±3.3a 82.1±7.2a 80.3±6.1b

2.2 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗渗透调节物质含量的影响结果见表2。添加0.5 g·L-1GABA 可以显著增加低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的含量。与对照组相比，培养基中添加0.5g·L-1GABA，怀玉1 号和怀玉2 号试管苗可溶性蛋白含量分别增加47.66%和69.99%，可溶性糖含量分别增加46.76%和46.79%，脯氨酸含量分别增加47.47%和56.41%。

表2 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗渗透调节物质含量的影响（±s，mg·g-1）Table 2 Effect of GABA on the content of osmotic regulating substances in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，mg·g-1）

表2 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗渗透调节物质含量的影响（±s，mg·g-1）Table 2 Effect of GABA on the content of osmotic regulating substances in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，mg·g-1）

注：相同指标不同小写字母表示两组间差异有显著性（P＜0.05）

GABA 浓度/（g·L-1）0 0.5可溶性蛋白怀玉1 号1.349±0.134b 1.986±0.256a怀玉2 号0.562±0.129b 0.879±0.092a怀玉2 号1.683±0.454b 2.861±0.652a可溶性糖怀玉1 号3.582±0.675b 5.257±0.872a怀玉2 号4.268±0.272b 6.265±0.429a脯氨酸怀玉1 号0.375±0.083b 0.553±0.182a

2.3 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗活性氧（ROS）含量及膜脂过氧化的影响结果见表3。添加0.5 g·L-1GABA 可以显著降低低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的相对电导率、H2O2含量、MDA含量和O2·-产生速率。与对照组相比，培养基中添加0.5 g·L-1GABA，怀玉1 号和怀玉2 号试管苗相对电导率分别降低32.96%和31.69%，H2O2含量分别降低35.46%和35.58%，MDA 含量分别降低22.24%和28.87%，O2·-产生速率分别降低33.44%和30.63%。

表3 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗活性氧含量及膜脂过氧化的影响（±s）Table 3 Effect of GABA on the content of ROS content and membrane lipid peroxidation in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

表3 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗活性氧含量及膜脂过氧化的影响（±s）Table 3 Effect of GABA on the content of ROS content and membrane lipid peroxidation in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

注：相同指标不同小写字母表示两组间差异有显著性（P＜0.05）

GABA 浓度/（g·L-1）0 0.5相对电导率/%怀玉1 号24.38±2.23a 16.25±1.56b怀玉2 号16.29±2.84a 11.28±1.69b怀玉2 号18.24±1.89a 12.46±1.13b H2O2/（mmol·g-1）怀玉1 号36.18±4.55a 23.35±2.78b怀玉2 号31.25±3.18a 20.13±1.87b MDA/（μmol·g-1）怀玉1 号46.27±7.23a 35.98±4.19b怀玉2 号42.15±4.45a 29.98±3.26b O2·-产生速率/（μmol·g-1·min-1）怀玉1 号18.57±2.14a 12.36±1.28b

2.4 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗抗氧化物质含量及抗氧化酶活性的影响结果见表4。添加0.5 g·L-1GABA 可以显著提高低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的GSH、AsA含量及SOD、POD、APX、GR活性。与对照组相比，培养基中添加0.5 g·L-1GABA，怀玉1 号和怀玉2 号试管苗GSH 含量分别提高84.67% 和72.52%，AsA 含量分别提高81.48%和90.62%，SOD 活性分别提高23.30%和38.63%，POD活性分别提高56.18%和79.91%，APX 活性分别提高61.22% 和64.13%，GR 活性分别提高40.50% 和50.74%。

表4 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗抗氧化物质含量及抗氧化酶活性的影响（±s）Table 4 Effect of GABA on the antioxidant content and antioxidant enzyme activity in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

表4 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗抗氧化物质含量及抗氧化酶活性的影响（±s）Table 4 Effect of GABA on the antioxidant content and antioxidant enzyme activity in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

注：相同指标不同小写字母表示两组间差异有显著性（P＜0.05）

GABA 浓度/（g·L-1）0 0.5 GSH/（μmol·g-1）怀玉1 号126.78±23.65b 238.11±36.28a怀玉2 号167.83±34.55b 289.54±26.82a AsA/（μg·g-1）怀玉1 号254.65±36.28b 462.15±39.05a怀玉2 号268.94±57.86b 512.64±76.23a SOD 活性/（U·g-1）怀玉1 号146.45±18.57b 180.58±32.88a怀玉2 号168.93±18.35b 238.19±32.16a GABA 浓度/（g·L-1）0 0.5 POD 活性/（U·g-1）怀玉1 号42.86±8.57b 66.94±12.41a怀玉2 号29.48±6.15b 43.57±8.31a怀玉2 号54.61±8.14b 98.25±12.67a APX 活性/（U·g-1）怀玉1 号3.88±1.53b 6.25±1.34a怀玉2 号5.63±1.24b 9.24±2.38a GR 活性/（U·g-1）怀玉1 号23.25±2.28b 34.68±4.16a

2.5 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗内源激素含量的影响结果见表5。添加0.5g·L-1GABA 可以显著提高低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的IAA、ZR、GA3和JA 含量，降低其ABA 含量。培养基中添加0.5 g·L-1GABA，怀玉1 号和怀玉2 号试管苗IAA含量分别是对照组的4.44 倍和4.21 倍，ZR 含量分别是对照组的2.27 倍和2.22 倍，GA3含量分别是对照组的1.58 倍和1.66 倍，JA 含量分别是对照组的1.46 倍和1.39 倍，ABA 含量分别是对照组的68.10% 和62.74%。

表5 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗内源激素含量的影响（±s，ng·g-1）Table 5 Effects of GABA on the endogenous hormone content of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，ng·g-1）

表5 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗内源激素含量的影响（±s，ng·g-1）Table 5 Effects of GABA on the endogenous hormone content of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，ng·g-1）

注：相同指标不同小写字母表示两组间差异有显著性（P＜0.05）

GABA 浓度/（g·L-1）0 0.5 IAA怀玉1 号2.85±1.03b 12.66±1.39a怀玉2 号38.23±2.27b 53.28±1.54a怀玉2 号3.86±0.98b 16.24±1.25a ZR怀玉1 号6.89±1.45b 15.63±3.76a怀玉2 号8.23±1.45b 19.26±2.87a GA3怀玉1 号24.68±3.15b 38.27±2.94a怀玉2 号26.28±3.26b 43.85±1.28a ABA怀玉1 号35.42±1.27b 24.12±2.85a怀玉2 号36.45±3.83b 22.87±2.51a JA怀玉1 号33.45±2.05b 48.82±1.19a

2.6 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗CHS和FLS 基因表达的影响结果见图1。与对照组（0 g·L-1GABA）相比，经0.5 g·L-1GABA 处理后可以显著提高低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的CHS基因的相对表达量（RQ 值），降低其FLS基因的相对表达量。培养基中添加0.5 g·L-1GABA 的怀玉1 号和怀玉2 号试管苗CHS基因的RQ 值分别是对照组的5.24 倍和8.24 倍，FLS基因的RQ 值分别是对照组的50.2%和33.4%。

图1 GABA 对低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗CHS 和FLS 基因表达的影响Figure 1 Effect of GABA on CHS and FLS gene expression of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress

2.7 低温胁迫下GABA 处理的怀玉山三叶青试管苗生长与生理指标的相关性分析结果见表6。增殖系数（MC）与株高（PH）、鲜质量（FM）、干质量（DM）、抗坏血酸（AsA）含量、吲哚乙酸（IAA）含量、玉米素核苷（ZR）含量、赤霉素（GA3）含量、茉莉酸（JA）含量均呈非常显著正相关关系（P＜0.01），与可溶性糖（SS）含量、还原型谷胱甘肽（GSH）含量和查尔酮合酶（CHS）基因表达均呈显著正相关关系（P＜0.05），但与黄酮醇合酶（FLS）基因表达呈非常显著负相关关系（P＜0.01），与超氧阴离子（O2·-）产生速率、过氧化氢（H2O2）含量和MDA 含量均呈显著负相关关系（P＜0.05）。说明低温胁迫下GABA 处理的怀玉山三叶青试管苗生长与吲哚乙酸（IAA）含量、玉米素核苷（ZR）含量、赤霉素（GA3）含量、茉莉酸（JA）含量、可溶性糖（SS）含量、抗坏血酸（AsA）含量、还原型谷胱甘肽（GSH）含量和查尔酮合酶（CHS）基因表达的提高正相关。因此，适当浓度的GABA可以调控内源植物激素和渗透调节物质含量、抗氧化物质含量以及次生代谢物关键基因表达，以促进低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的生长。

表6 低温胁迫下GABA 处理的怀玉山三叶青试管苗生长与生理指标的相关性分析Table 6 Correlation analysis between growth and physiological indexes of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain plantlets treated by GABA under low temperature stress

3 讨论

三叶青喜凉爽气候，较耐低温，在20～35 ℃时生长较好，冬春季平均温度低于5～10 ℃时，三叶青停止生长[36]。在江西上饶地区，怀玉山三叶青怀玉1 号和怀玉2号在4～7月、9月下旬～11月下旬地上部分快速生长，其他季节处于缓慢生长或休眠状态，在12 月～次年2 月由于温度低于5 ℃时，会发生冻害，需要套袋抗冻[37]。本试验结果表明，添加不同浓度（0.1～0.7 g·L-1）的GABA 可以显著促进低温胁迫下怀玉山三叶青2 个栽培种怀玉1 号和怀玉2 号试管苗增殖系数、株高、鲜质量及干质量的增加。其中，0.5 g·L-1GABA 的促进效应最好。本研究探究的低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗生长的GABA最适浓度与白明月等[22]在越橘试管苗以及宋春波[15]、方筱琴[16]和廖界仁[38]等在低温胁迫下桃和茶树的研究结果相同，但与郑友峰[39]在低温胁迫下苋菜的研究不同，究其原因，可能是因为植物种类存在差异所致。

在低温胁迫下，植物为了适应寒冷的环境，其内源激素含量会发生相应的变化，如低温胁迫后不同温敏性油菜的内源IAA 和ABA 含量呈先上升后降低的趋势[40]。低温处理下，肉饼类兜兰内源IAA 含量显著提高，而杏黄兜兰IAA含量则显著降低，黄花系肉饼兜兰、红花系肉饼兜兰和杏黄兜兰GA3和ZR 含量先增后减，ABA 含量在初期均突增[41]。GABA 是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，可作为信号分子调节植物抵抗逆境胁迫[42]。本试验结果表明，与对照组（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以显著提高低温胁迫下怀玉山三叶青2 个栽培种怀玉1 号和怀玉2 号试管苗的IAA、ZR、GA3和JA 含量，降低其ABA含量。低温胁迫下GABA处理引起怀玉山三叶青试管苗生长与生理指标的相关性分析也表明，低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的生长与IAA、ZR、GA3、JA 含量均呈非常显著正相关关系。但白明月等[22]发现，添加0.5 g·L-1GABA 可显著提高越橘试管苗IAA 和异戊烯基腺嘌呤（iPA）含量，降低ABA、GA3及茉莉酸甲酯（JA-me）含量。究其原因，可能是GABA处理越橘试管苗不是在低温胁迫条件下。

植物的抗寒性与抗氧化系统密切相关。在遭受低温胁迫时，植株体内会产生大量ROS，从而引起膜脂过氧化程度增加，造成膜系统损伤，导致植物生理生化代谢紊乱，并严重抑制植物生长发育[43]，抗坏血酸—谷胱甘肽（AsA-GSH））循环是植物体内清除ROS 的重要途径，其中AsA 和GSH 是AsA-GSH 循环中重要的抗氧化物质，既可直接还原ROS，又可以作为酶底物清除ROS[44]。同时植物还会以产生抗氧化酶等方式来清除体内产生的活性氧物质和自由基离子，从而抵御低温产生的伤害[45]。本试验结果表明，与对照组（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA可以显著提高低温胁迫下怀玉山三叶青怀玉1号和怀玉2号试管苗的GSH、AsA 含量及SOD、POD、APX、GR 活性。相关性分析也表明，低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的生长与AsA、GSH的含量呈显著正相关关系。本试验结果与白明月等[22]的越橘试管苗试验的结果一致。

植物会产生一系列生理生态变化响应低温胁迫。研究表明逆境胁迫引起的ROS[主要包括超氧阴离子（O2·-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）和单线态氧（1O2）等]大量积累将引起氧化胁迫[46]。这种氧化胁迫会导致植物细胞核酸功能发生改变，基因发生突变，蛋白质结构改变，酶活性降低，最终影响植物的正常生长发育[47]。细胞膜在植物抗逆性方面起着重要作用，膜系统的稳定性与植物的抗逆性密切相关。在低温胁迫下，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏，产生过多的ROS，引发或加剧膜脂质过氧化作用，造成细胞膜系统的损害。因此，清除ROS 是细胞膜保持良好稳定性的关键[48]。本试验结果表明，与对照组（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以显著降低低温胁迫下怀玉山三叶青怀玉1号和怀玉2 号试管苗的相对电导率、H2O2含量、MDA 含量和O2·-产生速率。相关性分析也表明，低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的生长与O2·-产生速率、H2O2和MDA 含量均呈显著负相关关系。本试验结果与白明月等[22]越橘试管苗试验的结果一致。

在低温胁迫下，植物的自身会产生对逆境的适应性反应，植物体内的渗透调节物质大量积累，使植物具有渗透调节的能力[49]。低温胁迫时，细胞内溶质主动积累，细胞渗透势下降，这是渗透调节的关键，参与渗透调节的物质种类有很多，其中可溶性糖、可溶性蛋白质、游离脯氨酸等含量会发生变化，保持植物细胞原生质与环境的渗透平衡以适应逆境[50]。植物在低温逆境条件下，通常以提高自身体内的可溶性糖含量来抵抗寒冷；同时低温胁迫还可引起植物体内可溶性蛋白质含量递增，并生成新的蛋白质，对植物的抗寒起到重要的调节作用；低温胁迫容易造成植物体内的游离脯氨酸含量发生较大变化，植物对低温胁迫的抗性强弱主要体现在游离脯氨酸积累的差异上[51]。本试验结果表明，与对照组（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以显著促进低温胁迫下怀玉山三叶青怀玉1 号和怀玉2 号试管苗可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的增加。相关性分析也表明，低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的生长与SS 含量呈显著正相关关系。本试验结果和贾琰等[20]越橘试管苗试验的结果一致，但与白明月等[22]越橘试管苗试验的结果不完全一致，与0 g·L-1GABA 相比，培养基中添加0.5 g·L-1GABA 后，越橘试管苗中可溶性蛋白含量无显著变化，但可溶性糖和脯氨酸含量非常显著增加。

在环境胁迫条件下，通过增加植物体内黄酮化合物来防御环境胁迫，黄酮作为植物综合防御体系的一部分，具有一定的清除氧自由基的能力[52]。CHS 是植物黄酮类化合物生物合成的关键限速酶，环境胁迫可诱导黄酮生物合成的关键酶CHS 的活性和含量上升[53]。类黄酮是植物次级代谢中很大的一个家族，其中黄酮醇是无色的次级代谢产物，FLS是类黄酮代谢中一个重要的节点酶[54]。黄酮醇在植物体内有着重要的生物学功能，不仅可调控植物花色形成、保护植物抵御紫外损伤，还可作为信号分子响应营养胁迫、调控植物生长激素运输等作用[55]。本试验结果表明，与对照组（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以显著提高低温胁迫下怀玉山三叶青怀玉1 号和怀玉2 号试管苗的CHS基因的相对表达量，促进黄酮生物合成，降低其FLS基因的相对表达量，减少黄酮醇生物合成。相关性分析也表明，低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的生长与查尔酮合酶（CHS）基因表达均呈显著正相关关系，但与黄酮醇合酶（FLS）基因表达呈非常显著负相关关系。