辛桂凝胶贴膏对糖尿病大鼠周围神经病变的影响

2024-02-04谭晓王慧雯申奥修彦凤王海颖上海中医药大学中药学院上海201203

中药新药与临床药理 2024年1期

谭晓，王慧雯，申奥，修彦凤，王海颖（上海中医药大学中药学院，上海 201203）

《中国2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》[1]显示，我国糖尿病（Diabetes mellitus，DM）患病率不断上升，2015 年至2017 年达到11.2%。糖尿病周围神经病变（Diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一。糖尿病神经病变（Diabetic neuropathy，DN）发病人数约占糖尿病患者人数的50%，其中DPN 约占DN 总数的75%[2]。DPN 患者主要表现为末端神经感觉受损和运动神经功能障碍，如双侧肢体远端呈对称性的麻木、感觉减退、发凉、触电感和疼痛等[3]。DPN 发病机制复杂，一般认为持续高血糖状态诱发的炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍和血脂异常，引起代谢障碍、缺氧缺血、神经营养因子水平降低，导致神经节段性脱髓鞘和轴突萎缩，引发周围神经功能障碍[4]。目前尚缺乏防治DPN 的特效药物，西医采用抗抑郁药、抗惊厥药或局部镇痛药对DPN 神经疼痛进行管理，但存在不良反应及成瘾倾向等问题[2]。辛桂凝胶贴膏处方为本课题组治疗DPN 的临床经验方，由肉桂、细辛、吴茱萸、川芎和冰片组成。肉桂为君药，温肾助阳、温通经脉、镇守命门真火；细辛驱寒化饮、宣痹通阳；吴茱萸暖肝散寒；川芎活血行气止痛；冰片芳香走窜，引药上行。诸药合用，共奏温补肾阳、通经活血之功效[5]。药理研究显示，方中肉桂、细辛、吴茱萸、川芎具有降血糖、改善胰岛素抵抗、抗炎、抗氧化应激和改善微循环的作用。因此，本研究旨在观察辛桂凝胶贴膏对DPN 模型大鼠周围神经的影响，以期为其临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物健康雄性SD 大鼠24 只，SPF 级，体质量（180±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。动物饲养于上海中医药大学实验中心SPF 级实验室，环境条件：室温20～24 ℃，相对湿度40%～70%，12 h 明暗周期，自由进食、饮水。适应性喂养1 周后开始实验。本实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会审批，批文号：PZSHUTCM220822012。

1.2 药物及试剂辛桂凝胶贴膏由本课题组自制，制备工艺如下：称取处方量甘羟铝、NP700、高岭土分散到甘油中，搅拌均匀，加入冰片乙醇溶液，搅拌均匀，得到A 相；取PVP-K30，加入适量的水充分溶胀后，加入酒石酸，搅拌溶解，得到B 相；将处方量提取的浸膏粉、挥发油包合物溶解于适量水中，搅拌均匀，得C 相。先将B 相与C 相混合，搅拌均匀，再加入A 相，搅拌均匀，涂布，密封包装，即得。

甲钴胺片（弥可保），卫材（中国）药业有限公司，批号：2205124；高脂高糖饲料（10.0%猪油、20.0%蔗糖、10.0%蛋黄粉、0.5%胆酸钠、59.5%常规饲料），无锡帆泊生物技术有限公司，批号：20221030、20221201；链脲佐菌素（STZ），美国Sigma 公司，批号：WXBD8507V；舒泰-50，法国维克有限公司，批号：BN8V8KA；空腹胰岛素（FINS）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20230222；苏木素-伊红（HE）染液，上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司，批号：230210。

1.3 主要仪器FA2004 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；RE5203 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；DZF-6050 型真空干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；罗氏活力血糖仪，上海罗氏制药有限公司；MB-580 型酶标分析仪，深圳汇松科技发展有限公司；YLS-6B 型智能热板仪，济南益延科技发展有限公司；AXIO Imager 2 型光学显微镜，德国蔡司（ZEISS）公司；BL-420F 生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；TAB-120FR 型全自动生化分析仪，日本TOSHIBA 公司； RM2235 型石蜡切片机，德国徕卡（LEICA）公司。

1.4 模型复制将24 只SD 雄性大鼠随机分为2 组，正常组6 只和造模组18 只，分别给予普通饲料和高脂高糖饲料喂养4周后，禁食不禁水12 h，单次腹腔注射1% STZ 溶液（35 mg·kg-1）；3 d 后，采用尾尖取血法检测大鼠随机血糖水平。以随机血糖值≥16.7 mmol·L-1为成功标准，复制2型糖尿病大鼠模型[4]。

1.5 分组及给药将复制成功的18只2型糖尿病模型大鼠随机分为3 组：模型组、甲钴胺组及辛桂凝胶贴膏组，每组6 只。第2 天开始药物干预，期间除正常组给予普通饲料外，其余各组大鼠均给予高脂高糖饲料。正常组、模型组大鼠给予生理盐水灌胃（2 mL·kg-1），甲钴胺组大鼠给予甲钴胺溶液灌胃（0.045 mg·kg-1），每天1 次；参考《实验针灸学》[6]穴位定位图解，辛桂凝胶贴膏组大鼠进行背部大椎及双侧肺俞、脾俞、肾俞穴位贴敷，以及后腿双侧阳陵泉、足三里穴位贴敷；辛桂凝胶贴膏大小为2 cm×2 cm，胶布常规固定4 h，每天1次，持续给药8 周。每天观察大鼠精神状态、饮食、活动、毛色光泽、尿量、排便等情况。

1.6 生化指标检测在药物干预第2、4、6、8 周分别进行1 次大鼠体质量和空腹血糖（FBG）检测。第8 周末，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射舒泰-50（50 mg·kg-1）麻醉后腹主动脉取血，静置、离心分离血清，采用全自动化生化分析仪检测FBG、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平；采用ELISA 法检测FINS 水平。计算：胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FINS（mIU·L-1）×FBG（mmol·L-1）/22.5。

1.7 测定大鼠热刺激缩足潜伏期第4、8 周末采用智能热板测试仪检测大鼠热刺激缩足反应潜伏期（Thermal withdrawal latency，TWL）。将大鼠提前置于23 ℃操作台10～15 min，待其状态平稳时将热板温度设定为（52±0.5）℃；记录大鼠开始出现舔足、跳跃等疼痛反应的时间，共检测3 次，每次间隔10 min，取3 次结果的平均值[9]；如果大鼠超过30 s仍未出现疼痛感表现则淘汰。

1.8 检测大鼠坐骨神经传导速度第8 周末检测大鼠的坐骨神经传导速度，包括运动神经传导速度（Motor nerve conduction velocity，MNCV）及感觉神经传导速度（Sensory nerve conduction velocity，SNCV）。采用舒泰-50 腹腔注射（50 mg·kg-1）麻醉大鼠，俯卧位固定；剪开坐骨结节处和踝关节坐骨神经经过部位的皮肤，小心分离暴露坐骨神经；麻醉状态下运用神经电生理法检测MNCV、SNCV。测定MNCV两次，分别将刺激电极置于坐骨神经近端和远端，近端和远端距离之差为2.0 cm，记录电极分别插入大鼠踝部和左足底第2 趾间。测定SNCV 将刺激电极置于同侧足背，记录电极两次分别置于坐骨神经近端和远端[4]。双极记录电极传递方波脉冲持续时间为1 ms，强度为2 mV；使用BL-420F 生物机能实验系统记录复合动作电位，从开始刺激到诱发电位出现的时间作为潜伏期。计算：MNCV（m·s-1）=两记录电极间距离/近端和远端潜伏期之差；SNCV（m·s-1）=刺激电极与记录电极间距离/近端和远端潜伏期之差。

1.9 HE 染色法观察大鼠坐骨神经组织病理变化将大鼠处死后在无菌操作台上分离坐骨神经，用10%中性福尔马林固定48 h；经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，制备约4 μm切片；切片经脱蜡、HE染色、脱水、透明、封片后，在光学显微镜下观察坐骨神经病理形态变化。

1.10 统计学处理方法采用SPSS 27.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状态观察正常组大鼠精神状态良好，饮食正常，动作敏捷，毛色顺滑有光泽，尿量正常，体质量逐渐增加。模型组大鼠表现出精神倦怠，动作迟缓，臀尾潮湿，毛色枯黄无光泽，拉尾排便，出现多饮、多食、多尿和体质量减轻等症状，辛桂凝胶贴膏组较模型组相关症状有所减轻。

2.2 辛桂凝胶贴膏对DPN 大鼠体质量及FBG 水平的影响结果见表1、表2。与正常组比较，模型组大鼠体质量显著降低（P＜0.01），FBG 水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，辛桂凝胶贴膏组大鼠体质量及FBG 水平无明显变化（P＞0.05）。结果表明，辛桂凝胶贴膏降血糖作用不明显，不宜单独使用。

表1 辛桂凝胶贴膏对糖尿病周围神经病变大鼠体质量的影响（±s，n=6）Table 1 Effect of Xin-Gui Gel Plaster on body mass in rats with diabetic peripheral neuropathy（±s，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01

组别正常组模型组甲钴胺组辛桂凝胶贴膏组体质量/g给药后8周564.80±28.70 403.22±59.10**419.68±28.15 457.42±50.05造模后0周367.77±20.81 354.93±17.75 355.38±14.33 360.65±21.23给药后2周473.93±27.07 390.87±32.37**376.10±19.68 391.82±17.92给药后4周519.67±28.26 399.75±40.73**394.58±19.01 420.88±44.16给药后6周554.73±25.87 419.27±47.07**418.43±19.31 449.88±49.32

表2 辛桂凝胶贴膏对糖尿病周围神经病变大鼠FBG 水平的影响（±s，n=6）Table 2 Effect of Xin-Gui Gel Plaster on FBG in rats with diabetic peripheral neuropathy（±s，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

FBG/（mmol·L-1）组别给药后8周4.95±0.29 24.00±5.71**25.36±2.54 19.53±10.29正常组模型组甲钴胺组辛桂凝胶贴膏组造模后0周7.22±0.56 31.80±1.77**31.32±3.07 30.37±3.31给药后2周7.08±0.56 32.05±3.06**31.68±1.82 23.43±9.11#给药后4周5.85±0.21 21.10±5.01**20.87±5.91 19.90±6.60给药后6周5.98±0.63 21.72±6.70**24.71±4.74 16.72±6.62

2.3 辛桂凝胶贴膏对DPN 大鼠TC、TG、FINS 水平及HOMA-IR 的影响结果见表3。与正常组比较，模型组大鼠的TC、TG 水平及HOMA-IR 明显升高（P＜0.05，P＜0.01），FINS水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，辛桂凝胶贴膏组大鼠的FINS 水平明显升高（P＜0.05），HOMA-IR 明显降低（P＜0.05），TC、TG水平无明显变化（P＞0.05）。结果表明，辛桂凝胶贴膏能够一定程度提高DPN 大鼠的FINS 水平，改善胰岛素抵抗。

表3 辛桂凝胶贴膏对糖尿病周围神经病变大鼠TC、TG、FINS 水平及HOMA-IR 的影响（±s，n=6）Table 3 Effects of Xin-Gui Gel Plaster on TC，TG，FINS and HOMA-IR in rats with diabetic peripheral neuropathy（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

FINS/（mIU·L-1）38.00±11.38 10.97±5.69**10.13±4.16 19.71±6.40#TC/（mmol·L-1）1.33±0.11 2.10±0.60*1.76±0.48 1.69±0.87 TG/（mmol·L-1）0.71±0.17 1.36±0.85*1.04±0.43 0.85±0.44 HOMA-IR 2.46±1.24 16.73±8.37**16.13±5.29 6.33±1.98#组别正常组模型组甲钴胺组辛桂凝胶贴膏组

2.4 辛桂凝胶贴膏对DPN 大鼠TWL、MNCV 及SNCV 的影响结果见表4。正常组比较，模型组大鼠的TWL、 MNCV 及SNCV 显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，甲钴胺组及辛桂凝胶贴膏组大鼠的TWL、MNCV 及SNCV 显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，辛桂凝胶贴膏对DPN 大鼠的周围神经具有保护作用，可缓解热刺激敏感度，并提高坐骨神经传导速度。

表4 辛桂凝胶贴膏对糖尿病周围神经病变大鼠TWL、MNCV及SNCV 的影响（±s，n=6）Table 4 Effects of Xin-Gui Gel Plaster on thermal withdrawal latencymotor and sensory nerve conduction velocity in rats with diabetic peripheral neuropathy（±s，n=6）

注：TWL 为热刺激缩足反应潜伏期；MNCV 为运动神经传导速度；SNCV 为感觉神经传导速度。与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组模型组甲钴胺组辛桂凝胶贴膏组TWL/s给药4周后15.76±2.31 8.12±2.21**13.38±3.03##11.75±1.19#给药8周后15.20±2.31 6.38±2.89**13.37±4.02##10.89±4.00#MNCV/（m·s-1）SNCV/（m·s-1）29.46±5.01 11.60±2.09**28.12±4.42##22.10±1.09#43.12±4.04 21.27±4.84**38.46±4.04##35.10±0.87#

2.5 辛桂凝胶贴膏对DPN 大鼠坐骨神经组织病理变化的影响结果见图1。正常组大鼠坐骨神经无明显病理变化，有髓神经纤维排列有序且致密，形态正常，结构完整。与正常组比较，模型组大鼠坐骨神经可观察到结构异常，神经纤维排列紊乱松散，出现较多散在空洞及髓鞘脱失、轴突萎缩。与模型组比较，甲钴胺组及辛桂凝胶贴膏组大鼠的坐骨神经病变情况得到不同程度改善，神经纤维排列较规则，髓鞘缺失和轴突萎缩明显改善。

图1 辛桂凝胶贴膏对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经组织病理变化的影响（HE 染色，×400）Figure 1 Effect of Xin-Gui Gel Plaster on pathological changes of sciatic nerve in rats with diabetic peripheral neuropathy（HE staining，×400）

3 讨论

本研究采用单次腹腔注射1% STZ（35 mg·kg-1）复制2型糖尿病大鼠模型，然后通过长期高脂高糖饮食诱导产生糖尿病周围神经病变（DPN）。结果表明，与正常组比较，模型组大鼠体质量、FINS 水平、TWL、MNCV 及SNCV[7]显著降低，FBG、TC、TG 水平及HOMA-IR 显著升高，坐骨神经组织细胞出现脱髓鞘、轴突萎缩、神经排列松散和空泡样变性等病理学现象，表明DPN 大鼠模型复制成功。在辛桂凝胶贴膏治疗后，DPN 大鼠的体质量及FBG、TC、TG 水平无明显变化，但FINS 水平、TWL、MNCV 及SNCV显著升高，HOMA-IR 明显降低，坐骨神经脱髓鞘、轴突萎缩、神经排列松散和空泡样变性的现象明显改善。本研究结果提示，辛桂凝胶贴膏可提高DPN大鼠的神经传导速度和延长热缩足反应潜伏期，对周围神经组织细胞具有一定保护作用，但降血糖作用不明显，需要联合其他降糖药物使用。

中医认为DPN 属“痹症”范畴，以气血阴阳亏虚为本，痰浊瘀血阻滞经络为标，常用治法包括补气养阴、温经补肾、活血化痰通络等[2]。辛桂凝胶贴膏处方由肉桂、细辛、吴茱萸、川芎和冰片组成，具有温补肾阳、通经活血的功效，为治疗DPN 的临床经验方。药理研究[8-11]表明，肉桂中的醛类化合物（如桂皮醛）具有降低血糖、抗氧化、提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗和减轻高血糖引起的神经炎症等作用，其中桂皮醛、β-荜澄茄烯等具有缓解疼痛和加速药物透皮吸收的作用。吴茱萸中的生物碱类活性成分（如吴茱萸碱）能有效降低血糖和血脂水平，减轻2型糖尿病大鼠胰岛细胞受损，降低胰岛素抵抗，以及发挥抗炎作用[12-14]。细辛中的木脂素类活性成分可以有效降低血糖，减轻高血糖引起的神经元损伤和氧化应激，抑制炎症介质白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和NO的产生[15-17]。川芎乙醇提取物中含有阿魏酸、川芎嗪和藁本内酯等，可有效抑制STZ诱导的糖尿病大鼠体内的氧化应激和炎症反应，下调血糖、血脂及糖化血红蛋白水平，改善胰岛素抵抗[18-19]；川芎及其提取物还具有扩张周围血管，改善微循环及神经细胞缺血缺氧状态的作用，从而缓解神经细胞的损伤与凋亡[20]。诸药合用，活性成分通过透皮吸收进入血液，促进血液循环，营养周围神经细胞，改善神经细胞病理损伤，促进周围神经损伤修复，提高神经传导速度。

DPN是糖尿病慢性疾病并发症，其发病机制复杂且尚未完全清楚。长期胰岛素缺乏或胰岛素抵抗会导致胰岛素受体通过P13K/AKT途径促进细胞凋亡[21]。长期高血糖和血脂异常引起的神经细胞凋亡参与了氧化应激、炎症反应、内质网应激、神经营养因子不足、自噬功能障碍等病理过程[22]。持续高血糖状态会诱导炎症反应的产生，TNF-α、IL-6、IL-1β、核因子κB（NF-κB）等炎症因子水平显著升高，从而诱导细胞中的氧化应激反应，最终引起神经细胞凋亡，DPN 可能与炎症因子水平升高密切相关[23-24]。髓鞘是维持外周神经系统结构和功能的重要组成部分，高血糖诱导神经细胞内质网应激，阻碍内质网对髓鞘蛋白的合成，髓鞘的损伤或缺失也是导致周围神经系统病变的重要原因。高血糖还能够诱导神经细胞线粒体产生大量活性氧（ROS），导致神经细胞线粒体DNA 损伤，进而引起神经细胞凋亡、轴突萎缩变性和髓鞘损伤缺失，最终导致神经传导异常[25]。本研究结果显示，辛桂凝胶贴膏能改善坐骨神经脱髓鞘、轴突萎缩、神经细胞排列松散和空泡样变性的病理改变，改善神经传导速度，延长热刺激缩足反应潜伏期，降低末端神经病理性敏感度，可能与其扩张周围血管，改善微循环，促进周围神经损伤修复有关。

综上所述，辛桂凝胶贴膏的降糖、降血脂作用不明显，但可缓解DPN 大鼠的热刺激敏感度，并提高坐骨神经传导速度，对DPN 大鼠的周围神经具有保护作用，并能一定程度改善胰岛素抵抗。辛桂凝胶贴膏可能有助于缓解DPN 患者的临床症状，以及预防早期糖尿病患者和糖尿病高危人群发生DPN，其作用机制有待深入探究。