右美托咪定对脑出血小鼠肥大细胞激活及神经功能损伤的影响

杨正宇,毛庆祥

(陆军军医大学大坪医院麻醉科,重庆 400042)

脑出血是一种危及生命的重大疾病,其致残率和病死率都很高[1-2]。肥大细胞来源于造血干细胞,分布于机体组织、器官、血管周边[3]。研究发现,脑出血后会诱发脑内肥大细胞激活,并释放类胰蛋白酶、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等物质,从而加重脑出血后脑损伤[4]。右美托咪定是一种具有镇静、镇痛和抗炎作用的α受体激动剂[5],对神经系统具有保护作用[6],但其对脑出血神经功能恢复的作用及机制不明。有研究报道,右美托咪定可抑制心脏肥大细胞脱颗粒从而减轻心肌缺血再灌注损伤[7],然而右美托咪定能否抑制脑内肥大细胞激活从而改善脑出血后神经功能尚未见文献报道。本研究通过建立小鼠脑出血模型,探讨肥大细胞激活在小鼠脑出血后脑损伤中的作用及右美托咪定对小鼠脑出血后脑保护作用的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

27只雄性昆明鼠(25～30 g)购自重庆医科大学动物中心,小鼠饲养环境：温度18～28 ℃,相对湿度40%～80%,每天进食正规鼠粮。本实验符合《实验室动物饲养和使用条例》并通过重庆医科大学医学研究伦理委员会审查。将小鼠按随机数字表法分为对照组(Sham组)、脑出血组(ICH组)和右美托咪定组(Dex组),每组9只,ICH组在小鼠脑内注射30 μL自体血,Sham组不注射自体血,Dex组在脑出血造模前30 min经腹腔注射右美托咪定(扬子江药业集团有限公司,H20183219)50 μL/kg。

1.2 方法

1.2.1脑出血模型 根据LI等[8]的方法制备脑出血模型：1%戊巴比妥钠5 mL/kg腹腔给药麻醉小鼠,并将小鼠置于神经定位仪(深圳市瑞沃德有限公司),以小鼠前囟为坐标,首先向前移动0.5 mm,然后向右移动2.3 mm,最后垂直向下移动3.7 mm。用肝素液润滑过的微量注射器(上海市高鸽工贸公司)采集小鼠尾部自体血30 μL注射,注射完毕后使微量注射器停留于靶注射点,10 min后缓慢退出微量注射器,以此来模拟脑出血,最后进行彻底消毒,缝合切口。造模成功后24 h进行神经功能检测,随即进行脑含水量检测、HE染色、免疫荧光染色和Western blot实验。

1.2.2神经行为学评分

根据LIU等[9]评分指标,采用mNSS测试检测小鼠神经功能,mNSS测试分为运动实验、感觉实验、平衡木实验及反射丧失和不正常运动实验,4项实验的评分总和为mNSS测试评分,mNSS测试最低评分0分,最高评分18分,评分越高说明神经功能损伤越严重。实验采用双盲法。

1.2.3苏木精-伊红染色

小鼠麻醉后经心尖灌注4 ℃ 0.9%氯化钠(30 mL/只),并用4%多聚甲醛固定(30 mL/只),然后将脑组织置于蔗糖溶液中脱水,最后将脑组织包埋,放置于冰冻切片机中,20 min速冻,切取厚度为10 μm的脑冠状切片,HE染色液(上海Sangon Biotech有限公司)染色脑组织切片5 min,然后用清水冲洗切片,0.1%盐酸乙醇分色15 s,最后将组织切片放入95%乙醇脱水并用二甲苯澄清,装片。每组各取小鼠3只,共9只,在小鼠脑出血后24 h进行。

1.2.4脑含水量测定

小鼠断头取脑,分别测量脑组织的湿重和干重,并计算脑含水量,计算公式为：(湿重-干重)/湿重×100%。每组各取小鼠3只,共9只,在小鼠脑出血后24 h进行。

1.2.5免疫荧光染色

将30 μL封闭液滴加到组织切片上,经过1 h封闭,晾干后滴加20 μL(1∶100)小鼠抗小鼠类胰蛋白酶单克隆抗体(1∶1 000,美国Novus Biologicals公司),并将其置于4 ℃冰箱孵育过夜。次日,用0.01% PBST漂洗组织切片15 min,重复3次,晾干后滴加20 μL美国Abbkine公司FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶100),置于37 ℃温箱中孵育1 h,以确保完全结合,然后用0.01% PBST漂洗15 min并重复3次,晾干后滴加DAPI(上海碧云天生物技术公司)溶液20 μL,最后封片并将切片置于荧光显微镜下计算肥大细胞数量。每组小鼠3只,共9只,在小鼠脑出血后24 h进行。

1.2.6Western blot

将小鼠麻醉后暴露心脏,然后经心尖灌注生理盐水30～40 mL,取出小鼠大脑,分离出血侧脑组织称重,每1 g脑组织中加入8 mL的组织裂解液,并将其充分研磨后,静置15 min,然后置于4 ℃离心机,12 000 r/min离心20 min,提取上清液,与5×loading buffer以4∶1的配比混匀,最后在95 ℃的温度下煮5 min。将上样蛋白样品通过SDS-PAGE电泳和电转(250 mA,30～50 min)转移到PVDF膜上,在37 ℃摇床封闭2 h后,将小鼠抗小鼠类胰蛋白酶单克隆抗体、兔抗小鼠IL-1β和TNF-α单克隆抗体(1∶700,美国Affinity公司)和大鼠抗小鼠β-actin多克隆抗体(1∶5 000,美国Santa Cruz公司)滴加到PVDF膜上,并放入4 ℃冰箱孵育过夜。次日,用0.01% PBST清洗PVDF膜3次,每次10 min,然后将PVDF膜放入稀释比为1∶5 000的二抗液中孵育1 h,再次清洗PVDF膜3次,每次10 min。最后将ECL发光液100 μL滴加到PVDF膜,静置30 s后,置于凝胶成像仪(广州光仪科技公司)中检测蛋白表达量。每组各取小鼠3只,共9只,在小鼠脑出血后24 h进行。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 右美托咪定减轻小鼠脑出血后神经运动功能障碍

mNSS测试结果显示,ICH组小鼠神经运动功能评分较Sham组明显提高(P<0.05),而Dex组神经运动功能评分较ICH组有所下降(P<0.05),较Sham组神经运动功能评分提高(P<0.05),见图1。

图1 各组小鼠神经运动功能损伤程度

2.2 右美托咪定减轻小鼠脑出血后脑水肿

HE染色结果显示,与Sham组相比,ICH组血肿周围脑组织肿胀明显,表现为空泡样自溶坏死,而Dex组一定程度逆转了这一现象。脑含水量检测结果显示,ICH组右侧大脑含水量明显高于Sham组(P<0.05),而Dex组右侧大脑含水量明显低于ICH组(P<0.05),见图2。

A：Sham组HE染色图,Bar=50 μm;B：ICH组HE染色图,Bar=50 μm;C：Dex组HE染色图,Bar=50 μm;D：脑含水量检测结果。a：P<0.05,与Sham组比较;b：P<0.05,与ICH组比较。

2.3 右美托咪定减少小鼠脑出血后肥大细胞数量

免疫荧光结果显示,ICH组血肿周围肥大细胞数量较Sham组增多(P<0.05),而Dex组肥大细胞数量较ICH组减少(P<0.05),见图3。

A：肥大细胞数量统计图;B：免疫荧光染色图,Bar=50 μm。a：P<0.05,与Sham组比较;b：P<0.05,与ICH组比较。

2.4 右美托咪定降低小鼠脑出血后脑内类胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表达

Western blot结果显示,ICH组小鼠脑内类胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表达较Sham组明显增加(P<0.05),而Dex组小鼠脑内类胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表达较ICH组明显减少(P<0.05),见图4。

3 讨 论

脑出血后会引发神经功能损伤,血肿对脑组织的压迫会导致原发性脑损伤,而脑出血后血肿周围的一系列病理生理反应会导致继发性脑损伤[10-12]。然而,有关脑出血后继发性脑损伤的机制尚不完全清楚,缺乏有效的防治措施。有研究发现,脑出血会诱发脑内肥大细胞激活并发生脱颗粒从而加重脑出血后炎性反应,进而加重脑出血后继发性脑损伤[13]。本研究结果显示,小鼠脑出血后脑组织内类胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表达量增加,并且血肿周围肥大细胞数量增多,这表明脑出血后肥大细胞激活,从而引发肥大细胞脱颗粒,这与之前的研究结果相符。

右美托咪定对脑出血后脑损伤有保护作用,有研究指出,右美托咪定通过抑制神经元自噬作用、凋亡和炎性反应而起到神经保护作用[14-18]。临床研究表明,右美托咪定对高血压脑出血患者具有一定的脑保护作用,并且对患者的呼吸和循环影响较小,是高血压脑出血患者围术期镇静镇痛治疗的安全有效药[19-20]。另有研究报道,右美托咪定可以有效抑制肥大细胞激活,从而减轻脊髓缺血再灌注损伤。此外,研究还发现,右美托咪定通过抑制肥大细胞激活来减轻丁哌卡因诱发的坐骨神经炎性反应[21-22]。在本研究中,Western blot实验表明：右美托咪定可以降低小鼠脑出血后类胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α的表达;免疫荧光实验和甲苯胺蓝染色实验结果显示：右美托咪定明显减少了小鼠脑出血后血肿周围肥大细胞数量,从而减轻了小鼠脑出血后脑水肿和神经功能损伤。因此,笔者推测右美托咪定可通过抑制肥大细胞激活而减轻小鼠脑出血后脑损伤。然而,右美托咪定抑制肥大细胞激活的具体机制需要更深一步探究,有研究报道,右美托咪定通过抑制内质网应激反应而减轻小鼠脑损伤[23],在后续的研究中本课题组将探索右美托咪定是否通过抑制内质网应激反应而减轻肥大细胞脱颗粒,从而减轻脑出血后脑损伤。

综上所述,小鼠脑出血后,脑内肥大细胞激活并加重神经功能损伤。右美托咪定可能通过抑制肥大细胞激活而改善神经功能损伤。本实验是在小鼠脑出血前给予右美托咪定,而对于脑出血后给予右美托咪定能否减轻脑出血后脑损伤值得研究,本实验对右美托咪定的脑保护作用提出了新的观点。