北京地区猫4种肠道原虫流行病学调查

洪慧颐,张兆霞,宋世豪,于咏兰

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

腹泻是猫常见的临床症状,可由多种因素引起,原虫是导致猫慢性腹泻的重要病原,其中胎儿三毛滴虫(Tritrichomonasfoetus)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardiaduodenalis)、隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)和囊等孢球虫(Cystoisosporaspp.)(旧称为等孢球虫)较为常见,诊疗不当可发展为慢性腹泻,进一步导致脱水、电解质紊乱、酸碱失衡、营养不良和肠道菌群失调等多种并发症[1]。其中,蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫是引起人类水源性腹泻的重要人兽共患病病原,在养猫数量日益增加的今天,尤其具有不可忽略的公共卫生学意义。北京地区猫群数量庞大,却罕见上述4种肠道原虫的相关流行病学数据,因此,本试验使用分子生物学方法对北京地区猫群体的这4种原虫进行调查,并对其中的蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫进行分子分型,评估感染风险因子和潜在的人兽共患风险,以期为临床疾病的诊疗和人兽共患病的预防提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集 2021年6—12月,于中国农业大学教学动物医院采集猫的粪便样本共628份,记录样本相关信息,包括年龄、性别、品种、绝育情况、免疫史、驱虫史和症状(是否腹泻/软便)。

1.2 主要试剂 TIANamp Stool DNA Kit粪便基因组DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;2 × High-GC PCR StarMix with Loading Dye和2×TaqPCR StarMix with Loading Dye,均购自北京康润诚业生物科技有限公司;BIOWEST Regular Agarose G-10,购自上海贝晶生物技术有限公司;Ultra GelRed(10 000×),购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;DL-1 000 DNA Marker,购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.3 主要仪器 DW-HL218型超低温冷冻储存箱,购自中科美菱低温科技股份有限公司;YXQ-50SⅡ型高压灭菌锅,购自北京隆丰天科技有限公司;Sorvall Legend Micro 17R微量离心机,购自美国赛默飞世尔科技公司;HWS12型电热恒温水浴锅,购自上海一恒科技有限公司;DYY-6C型电泳仪和WD-9413B型凝胶成像分析仪,均购自北京六一生物科技有限公司;Bio-Best135A型凝胶成像系统,购自美国SIM公司。

1.4 试验方法

1.4.1 形态学检查 使用生理盐水冲洗直结肠获得粪便样本后,吸取一滴样本滴于载玻片上,盖上盖玻片后于光学显微镜下观察,记录镜检结果。

1.4.2 DNA提取 按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取粪便DNA,DNA样本存于-20 ℃备用。

1.4.3 PCR扩增 分别对胎儿三毛滴虫的ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因、蓝氏贾第鞭毛虫核糖体RNA小亚基(Small subunit ribosomal ribonucleic acid,SSU rRNA)基因、隐孢子虫SSU rRNA基因和囊等孢球虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit 1,mtCOI)基因进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增,以统计分析这4种原虫在北京地区猫群中的感染率。对蓝氏贾第鞭毛虫PCR阳性样本进一步通过PCR扩增β-贾第素(β-giardin,bg)、谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,gdh)和磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase, tpi)基因;对隐孢子虫PCR阳性样本进一步通过PCR扩增微小隐孢子虫60 kDa糖蛋白(Glycoprotein 60,gp60)基因和猫隐孢子虫gp60基因,以对蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫进行分子分型。PCR扩增的引物序列、反应体系和反应程序参照参考文献进行(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样本的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表1 肠道原虫PCR扩增的目的基因和引物序列Table 1 Target genes and primer sequences for PCR amplification of intestinal protozoa

1.4.4 序列比对和系统进化关系分析 在GenBank数据库中搜索蓝氏贾第鞭毛虫不同集聚体(Assemblage)的基因序列并下载,使用Snapgene 6.0.2修饰PCR产物测序结果,并与相关序列进行比对,以区分集聚体类型。在GenBank数据库中搜索隐孢子虫不同基因型的基因序列并下载,使用Snapgene 6.0.2修饰PCR产物测序结果,并与相关序列进行比对,以区分基因型。使用MEGA 11.0.11的邻接法(Neighbor Joining,NJ)构建隐孢子虫gp60基因的系统进化树,Bootstrap Replications设为1 000次重复。

1.4.5 感染风险因素的评估和分析 使用Excel记录整理病例信息和检测结果,使用IBM SPSS Statistics 28.0.0.0进行卡方检验,分析年龄、性别、品种、绝育情况、免疫史、驱虫史和症状(是否腹泻/软便)与4种肠道原虫感染率的相关性。

2 结果

2.1 北京地区猫肠道原虫感染情况 本试验共收集了628份粪便样本,肠道原虫的总感染率为20.22%(127/628),胎儿三毛滴虫感染率为10.19%(64/628)、蓝氏贾第鞭毛虫感染率为6.69%(42/628)、隐孢子虫感染率为4.46%(28/628)、囊等孢球虫感染率为3.03%(19/628);其中106份样本仅感染1种原虫,16份样本感染2种原虫,5份样本感染3种原虫,混合感染率为16.54%(21/127)。部分样本的PCR扩增结果如图1所示。测序结果显示,28例隐孢子虫均为猫隐孢子虫(Cryptosporidiumfelis),19例囊等孢球虫包括14例猫囊等孢球虫(Cystoisosporafelis)和5例芮氏囊等孢球虫(Cystoisosporarivolta)。

图1 部分样本的肠道原虫PCR扩增Fig.1 PCR amplification of intestinal protozoa from some samplesA:胎儿三毛滴虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因; B:蓝氏贾第鞭毛虫SSU rRNA基因; C:隐孢子虫SSU rRNA基因;D:囊等孢球虫mtCOI基因; M:DL-1 000 DNA相对分子质量标准; +:阳性对照; -:阴性对照; S:样本A:ITS1-5.8S rRNA-ITS2 gene of Tritrichomonas foetus; B:SSU rRNA gene of Giardia duodenalis; C:SSU rRNA gene of Cryptosporidium spp.; D:mtCOI gene of Cystoisospora spp.; M:DL-1 000 DNA Marker; +:Positive control; -:Negative control; S:Sample

2.2 感染风险因素的评估和分析 对不同年龄、性别、品种、绝育情况、免疫史、驱虫史和症状(是否腹泻/软便)的猫粪便样本进行统计分析,结果如表2所示,纯种猫更易感染胎儿三毛滴虫和蓝氏贾第鞭毛虫(P<0.05),患猫的主要临床症状是腹泻或软便(P<0.01);年龄小于1岁、雌性和未绝育的猫更易感染隐孢子虫(P<0.05或P<0.01),且单一感染隐孢子虫的猫均为表现腹泻/软便的症状;年龄小于1岁、未绝育、未免疫和未驱虫的猫更易感染囊等孢球虫(P<0.01);其余因素与4种肠道原虫感染率无显著相关性(P>0.05)。

表2 北京地区猫肠道原虫感染情况Table 2 Intestinal protozoa infection status in cats in Beijing

2.3 蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫的分子分型 通过镜检和PCR扩增共检出蓝氏贾第鞭毛虫感染样本42份,其中SSU rRNA、bg、gdh和tpi四个基因的扩增效率分别为97.6%(41/42)、71.4%(30/42)、69.0%(29/42)和42.9%(18/42),另有1份镜检阳性样本4个基因的PCR扩增结果均为阴性。通过PCR扩增共检出隐孢子虫28份,SSU rRNA基因测序结果均为猫隐孢子虫,其中PCR扩增检出微小隐孢子虫gp60基因0份,猫隐孢子虫gp60基因25份,即本试验所得28份隐孢子虫阳性样本均为猫隐孢子虫,无混合感染情况,猫隐孢子虫gp60基因扩增效率为89.29%(25/28)。部分样本的分子分型PCR扩增结果如图2所示。

图2 部分样本的蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫分子分型PCR扩增Fig.2 PCR amplification of molecular subtyping of Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp. in some samplesA:蓝氏贾第鞭毛虫bg基因; B:蓝氏贾第鞭毛虫gdh基因; C:蓝氏贾第鞭毛虫tpi基因; D:微小隐孢子虫gp60基因; E:猫隐孢子虫gp60基因; M:DL-1 000 DNA相对分子质量标准; M2:DL-2 000 DNA相对分子质量标准; +:阳性对照; -:阴性对照; S:临床样本A:bg gene of Giardia duodenalis; B:gdh gene of Giardia duodenalis; C:tpi gene of Giardia duodenalis; D:gp60 gene of Cryptosporidium parvum; E:gp60 gene of Cryptosporidium felis; M:DL-1 000 DNA Marker; M2:DL-2 000 DNA Marker; +:Positive control; -:Negative control; S:Sample

蓝氏贾第鞭毛虫SSU rRNA、bg、gdh和tpi基因的集聚体分型结果显示,在PCR扩增结果呈阳性的41例样本中,集聚体B占比最高,为63.41%(26/41),其次为集聚体F,占比为29.27%(12/41),此外有1份集聚体C、1份集聚体AⅠ和1份集聚体A/F。所有样本于不同基因位点的分型结果一致,未见混合感染集聚体的情况。

将25份猫隐孢子虫gp60基因PCR扩增结果呈阳性样本的基因序列与GenBank中公布序列进行比对,将本试验获得的分离株命名为“编号+Cat Beijing”,系统进化树如图3所示,25份猫隐孢子虫阳性样本中,有23份属于XIXa亚型家族,有2份属于XIXc亚型家族。

图3 基于猫隐孢子虫gp60基因构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the gp60 gene of Cryptosporidium felis▲:本试验所得分离株▲:The isolates obtained in this study

3 讨论

本试验首次对北京地区猫胎儿三毛滴虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫和囊等孢球虫的感染情况进行了分子流行病学调查。感染率由高到低分别为胎儿三毛滴虫(10.19%,64/628)、蓝氏贾第鞭毛虫(6.69%,42/628)、隐孢子虫(4.46%,28/628)和囊等孢球虫(3.03%,19/628)。这4种肠道原虫在世界范围内感染率分别介于0%～81.8%[12]、1.3%～27.3%[13]、0%～40.8%[14]和1%～67%[15],相比较而言,本试验所得的感染率中等偏低。分析其原因可能是因为肠道原虫在猫只数量密集、卫生条件有限的场所更容易传播,而本试验样本集中于动物医院采集,调查群体主要为家养宠物猫,未包含卫生条件较差或猫只数量密集的群体,如流浪猫或收容所猫。

本试验结果显示,猫的胎儿三毛滴虫和蓝氏贾第鞭毛虫感染率与品种相关,隐孢子虫的感染率与年龄、性别和绝育情况相关,囊等孢球虫的感染率与年龄、绝育情况、免疫史和驱虫史相关,此结果与国外部分研究结果一致[12,16-18]。目前,并没有足够的证据表明纯种猫在遗传或免疫方面更易感染寄生虫,出现这些差异的原因可能主要由密集的饲养环境引起。由于商业目的,纯种猫大多生活在多猫家庭或有多猫家庭生活史,这和收容所的猫生活环境类似,互相梳理毛发或共用猫砂盆均会增加原虫传播的风险;幼龄猫可能因为免疫系统尚不成熟所以更易感染寄生虫;猫的性别与肠道原虫易感性的相关性目前尚不明确。

本试验4种原虫的混合感染率为16.54%(21/127)。有研究显示,混合感染其他原虫有增加胎儿三毛滴虫感染风险和加重临床症状的可能[19]。本试验中单一感染隐孢子虫的病例均无明显胃肠道症状,但混合感染病例均表现软便或腹泻的临床症状,与另一研究结果相符[20]。因此,若确诊猫患有某一肠道原虫病,经治疗后症状未见明显好转时,建议排查是否存在其他原虫感染。

蓝氏贾第鞭毛虫病是在世界范围流行的重要人兽共患寄生虫病,分为集聚体A～H,其中集聚体A和B属于人兽共患基因型,集聚体F为猫易感型[18]。本试验结果显示,北京地区猫的蓝氏贾第鞭毛虫主要优势基因型为集聚体B,其次为集聚体F,此结果与广州市[21]和上海市[22]的调查结果相似。此外本试验检出1份样本为犬易感型集聚体C,为单一感染,且有软便的临床症状,另有研究在犬源和人源蓝氏贾第鞭毛虫中检测出猫易感型集聚体F[21,23],说明蓝氏贾第鞭毛虫存在于犬和猫、人和猫之间跨物种传播的可能。本试验结果表明,北京地区猫作为伴侣动物,有同时作为蓝氏贾第鞭毛虫宿主向人类传播疾病的可能性,因此若确诊猫患有蓝氏贾第鞭毛虫病,应建议主人加强个人卫生和环境卫生的管理,避免儿童或其他动物过多地接触患猫。

猫的隐孢子虫病在世界各地多有报道,微小隐孢子虫和猫隐孢子虫为主要优势虫种[14],在我国猫隐孢子虫是主要优势虫种[24-26]。本试验结果显示,北京地区猫的隐孢子虫主要优势虫种为猫隐孢子虫,未见微小隐孢子虫感染,与国内研究结果[24-25]相似。本试验基因分型结果显示,北京地区猫隐孢子虫的主要优势亚型家族是XIXa,此结果与国外相关研究结果[9,27-28]相符。此外,本试验有2株猫隐孢子虫分离株属于亚型家族XIXc,是首次发现猫源分离株来自于此亚型家族。

虽然普遍认为猫隐孢子虫是专性寄生于猫科动物的原虫,但已有相关报道显示,猫隐孢子虫可感染人类并引起腹泻症状[18,29]。在我国,已发现猫隐孢子虫存在于腹泻患者、艾滋病患者、无胃肠道症状患者和住院患者中[30]。在蒋文的研究中,从免疫健全和免疫缺陷的患者体内均可分离出猫隐孢子虫亚型家族XIXa、XIXc和XIXd,即无论患者的免疫功能如何,不同亚型的猫隐孢子虫均可能感染人类[27]。本试验所发现的猫隐孢子虫均属于人兽共患基因型,其中分离株622 Cat Beijing与参考序列MT458684的gp60基因有100%的同源性,MT458684序列源于1名尼日利亚的艾滋病患者,也与我国的恒河猴源样本同源,进一步指示了猫隐孢子虫跨物种传播的可能。因此,若临床中检测出猫携带隐孢子虫,应告知主人潜在的人兽共患风险,保持良好的卫生条件,确保水源的清洁,以避免隐孢子虫的传播。