牛副结核病的病原学和防控研究进展

刘蒙达,张皓博,亓 菲,沈叶盛,2,苏华彬,3,张 力,李 岩,孙淑芳,樊晓旭

(1.中国动物卫生与流行病学中心人畜共患病监测室,山东 青岛 266032 ; 2. 山东农业大学动物科技学院,山东 泰安 271018 ; 3. 青岛农业大学动物医学院,山东 青岛 266109 ; 4. 新疆生产建设兵团 畜牧兽医工作总站,新疆 塔城 832104)

牛副结核病(Bovine paratuberculosis)是一种由禽分枝杆菌亚种——副结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosis,MAP)引起的,主要影响反刍动物的慢性消耗性疾病。副结核病又称副结核性肠炎或约内氏病(Johne's disease),在实际临床中主要表现为肠炎、顽固性腹泻和渐进性消瘦等,肠黏膜增厚呈现脑回样变是其主要的病理变化[1]。在2022年6月29日我国农业农村部新发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中,虽然已将牛副结核病降为三类动物疫病[2],但该病所造成的经济损失和公共卫生影响仍然不可忽视。牛副结核病是影响全球奶牛业最严重的传染病之一,可造成产奶量减少、体重降低、扑杀/死亡和疾病控制成本增加等[3]。该病还是一种潜在的人兽共患病,人类食用被副结核分枝杆菌污染的牛奶或奶制品可造成过敏性肠道症状和溃疡性肠炎,即克罗恩病(Crohn's disease)。副结核分枝杆菌感染人类不一定会导致发病,但它可能是克罗恩病和其他疾病(比如1型糖尿病和多发性硬化症)的诱因之一[4]。牛副结核病难以诊断,病原分离周期长,且非结核分枝杆菌的组成复杂,我国相关研究报道较少且存在误区。本文旨在提炼性的阐述牛副结核病的病原学、流行病学、临床症状、诊断和防控策略等信息,以期为该病的预防和控制工作提供参考。

1 副结核病的发现

分枝杆菌对人类社会的影响有着相当长的历史。在公元前8 000年的骨骼化石中,科学家发现了由分枝杆菌感染引起的脊柱病变;肺部病变甚至可追溯到公元前1 000年[5]。1826年,Hurtrel Arboval发现患病牛出现与慢性腹泻有关的大肠和小肠黏膜增厚,这可能是有文献记载的人类最早发现的副结核病;1894年,Heinrich Albert Johne博士和Langdon Frothingham博士对1头生产性能不佳的奶牛进行剖检时,发现其肠黏膜增厚、肠系膜淋巴结肿大,炎症组织内有大量抗酸细胞浸润;研究认为该病病原是一种导致鸟类结核病的细菌(后来被称为“禽结核分枝杆菌”),并于1895年公开报道该病为“伪结核性肠炎”;直到1951年,英国科学家Frederick William Twort才从被枯草芽孢杆菌污染的培养基上偶然分离到副结核分枝杆菌[1]。

2 牛副结核病的病原学

副结核分枝杆菌属于禽分枝杆菌复合群,专性细胞内寄生,是一种杆状、革兰染色呈阳性的抗酸菌,其蜡质细胞壁由阿拉伯半乳聚糖连接的霉菌酸盐和肽聚糖层组成,对环境有很强的抵抗力[6]。有报道称,在不受阳光照射的干燥环境中,该菌存活时间长达55周[7];而在光照情况下,其存活时间可能会缩短到1周[8]。该菌寄生在宿主体内时,其细胞壁通常消失,从而对多种作用于肽聚糖的抗生素(如青霉素、头孢菌素和万古霉素)产生耐药性[9]。

由于副结核分枝杆菌无法产生分枝杆菌素(一种铁螯合化合物),影响了细胞膜对铁的转运,所以该菌的繁殖速度很慢,倍增时间一般为22～26 h[10]。该菌进行体外培养时,可选择罗氏固体培养基,于37 ℃恒温培养箱中生长,一般2～4周可见灰白色的结节状菌群。

根据生长特征、菌落色素沉着和宿主关联,可以将副结核分枝杆菌分成3个菌株组:绵羊型又称“S 型”(在自然条件下可感染羊,对牛也有轻微感染能力);牛型又称“C 型”(在自然条件下只感染牛,而不使羊发病);野牛型又称“B 型”;近期也有“骆驼型”的相关报道[6]。目前,我国已在奶牛中分离到“S型”和“C型”菌株,且“C型”为主要流行菌株[11]。根据IS900限制性片段长度多态性,可将该菌分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型(表1)。Ⅰ型主要分离自绵羊;Ⅱ型宿主较为广泛,在牛和多种动物以及人类均有分离的报道;Ⅲ型为“生物中间型”,是“S 型”的1个亚型[6]。

表1 副结核分枝杆菌的分型及其主要宿主Table 1 Types and main hosts of MAP

2.1 副结核分枝杆菌的致病机理 副结核分枝杆菌主要通过粪—口传播途径在牛中传播,其中犊牛最易感[12]。引入亚临床感染的动物被认为是造成畜群间传播的主要原因[13]。被感染的动物通过粪便和乳汁持续排菌。当动物经口暴露后,病原菌进入动物体内,首先定植在回肠和空肠的派尔集合淋巴结(Peyer's patch),然后扩散到肠道黏膜固有层[14]。幼年动物由于短暂性的派尔集合淋巴结细胞增加,表示出更强的易感性[15]。即使没有派尔集合淋巴结,副结核分枝杆菌仍然可以穿过上皮细胞到达肠壁细胞[16]。该菌可以抵抗活性氧中间体的作用,避免被降解[17]。当副结核分枝杆菌被树突状细胞和巨噬细胞吞噬后,可避免细胞凋亡、逃避溶酶体的吞噬,通过改变趋化因子和细胞因子信号传导来逃避识别,并抑制树突状细胞的分化成熟[15]。最终,病原菌随病畜粪便一同排出肠道,这也正是该菌通过粪—口传播途径持续排毒的原因[18]。在副结核发病牛的粪便(图1A)和肠系膜淋巴结(图1B)均可发现副结核分枝杆菌[19]。

图1 副结核分枝杆菌的镜检观察(萋尼染色,1 000×)[19]Fig.1 Microscopic observation of MAP (Zeni-Neelsen staining,1 000×)[19]A:粪便样品; B:肠系膜淋巴结样品A:Fece samples; B:Mesenteric lymph node samples

2.2 副结核分枝杆菌的毒力 引起副结核分枝杆菌对巨噬细胞侵入、定殖,以及疾病发展的毒力机制仍然难以确定。基于对分枝杆菌的研究,几种潜在相关因子被认为可能与宿主细胞相互作用,影响该菌的毒力和致病机理(表2)[17]。有研究通过改变特定基因,观察细菌毒力的变化,并在宿主体外确定了主要毒力因子的作用(表3)[17]。

表2 可能与副结核分枝杆菌毒力相关的潜在因子及其作用[17]Table 2 Potential factors and their functions that may be related to MAP virulence[17]

表3 副结核分枝杆菌的主要毒力因子及其作用Table 3 Main virulence factors and their functions of MAP

3 牛副结核病的流行病学

牛副结核病在全球范围内广泛流行,且对全球养牛业造成巨大的经济损失。据估算,集约化养殖的国家,奶牛副结核病的场群阳性率超过50%[20]。基于ELISA检测、细菌分离培养和PCR检测,美国的奶牛场群阳性率介于68%～91%,肉牛场群阳性率为8%[21];每头奶牛每年由该病造成的损失为21～79美元[21]。在英国,该病的感染率介于15%～33%,每年由该病造成的损失超过200万英镑,是导致奶牛淘汰的主要传染病之一[22]。

我国关于牛副结核病流行病学调查的研究较为有限。1955年,我国内蒙古自治区确诊首例牛副结核病病例,随后多个省份报道了确诊病例[22]。对2014年于北京7个奶牛场采集的8 549份血清样品进行ELISA检测,抗体阳性率为9.25%[23]。犊牛对副结核分枝杆菌的感染几乎没有体液免疫[12]。北京的调查研究也表明,2岁龄以下的犊牛血清样品抗体阳性率非常低;而2岁龄以上的血清样品抗体阳性率超过14%[23]。2018—2020年的一项研究显示,在大连市连续3年用ELISA方法检测奶牛血清中副结核分枝杆菌的抗体,阳性率呈现从8%降至2%再升到8%的波动趋势[24],分析原因可能与防控措施有关,也可能与2019年所检测样品以犊牛为主有关。2020年,对甘肃省227份奶牛血清进行副结核分枝杆菌抗体ELISA检测,结果显示,抗体阳性率为5.73%[11]。牛副结核病的传播速度缓慢,不同病例的出现往往间隔较长时间,部分研究认为该病呈现散发性,实际上该病是一种缓慢传播的地方流行性传染病[22]。

4 牛副结核病的临床症状

动物一旦感染副结核分枝杆菌,通常会有数年的无症状潜伏期[25]。同时,大量细胞外副结核分枝杆菌在血液中循环,刺激适应性免疫系统,引起机体产生特异性免疫应答[26]。当该菌成功定殖于肠道中时,机体便会出现特征性的肉芽肿、组织学和表观的病变,影响动物的营养吸收,导致病畜营养不良、渐进性消瘦,严重时造成病畜死亡(图2A)[19,27],剖检可见病牛回肠黏膜肿胀出血,有黏液脓性分泌物(图2B),肠系膜淋巴结可见明显的髓样肿胀(图2C)[19]。副结核病晚期的特征性迹象是严重腹泻和骨骼的表观病变[28]。

图2 副结核分枝杆菌感染牛的眼观病变[19]Fig.2 Gross lesions in cattle infected by MAP[19]A:病牛消瘦; B:回肠黏膜; C:肠系膜淋巴结A:Emaciated cattle; B:Ileal mucosa; C:Mesenteric lymph nodes

5 牛副结核病的诊断

感染副结核分枝杆菌的动物会出现细胞免疫和体液免疫分离的现象,细胞免疫随病情康复而增强,体液免疫随病情加重而增强[29]。在不同感染阶段,患病动物表现不同的病理、生理和免疫状态,加之长达数年的潜伏期和亚临床症状,给副结核病的诊断造成了很大的困难。

5.1 细菌分离培养 副结核分枝杆菌的分离培养具有高度特异性,被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)视为诊断副结核病的参考标准[22]。有多种培养基可供选择,包括Löwenstein-Jensen培养基、Herrold's卵黄培养基、Middlebrook 7H9、7H10和 7H11[17],一般常用含分枝杆菌生长素的Heirold's卵黄培养基。但是,动物在感染初期和漫长的潜伏期很少排菌,粪便采样很难成功分离培养该菌,而且该菌生长缓慢,通常需要培养2～4周,可能会错过最佳的诊断和淘汰期,造成疫病的传播。

5.2 染色镜检 副结核分枝杆菌细胞壁中含有大量糖脂,通常采用萋尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法进行染色[30]。该菌在显微镜下呈红色球杆状,成丛或成团存在,背景为蓝色。细菌染色镜检要求待检样品中含有一定的带菌量。该方法检测速度快、成本低,结果直观。但是该方法敏感性较低,难以检测到低浓度的细菌;而且它的特异性有限,无法区分其他抗酸杆菌。

5.3 分子生物学方法 副结核分枝杆菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测方法可参照国家标准(GB/T27637—2011),针对其特异性F57基因序列进行扩增检测。qPCR检测方法已经广泛应用对血液、牛奶、粪便和环境样品进行副结核分枝杆菌感染的诊断,该方法具有快速、灵敏的特点。有研究根据副结核分枝杆菌的特异片段IS900,设计了1对可用于分离菌株鉴定的引物[31]。需要注意的是,因为部分环境微生物基因组也能扩增出与预期大小相同或相近的片段,所以直接采用qPCR方法对待检样品进行检测可能会出现假阳性[32]。

5.4 抗体检测 目前,商品化的ELISA试剂盒主要用于检测牛奶或牛血清中的副结核分枝杆菌抗体。据报道,其检测特异性可达98%(临床疾病)[33]。相比细菌分离培养、PCR或qPCR,ELISA方法的成本低、工作周期短、方法标准化,适合大量样品的检测。但是,抗体检测的准确性与采样时间、动物病程和机体状态有关,ELISA检测需要病畜已进入体液免疫期,且因抗体水平不同,该方法的敏感度差异较大。澳大利亚的一项研究显示,对2～6岁不同年龄的奶牛进行副结核病的血清抗体检测,ELISA方法的敏感性介于1.2%～15%[33]。国内的一项研究发现,ELISA方法的敏感度不及PCR方法的一半[32]。但是,在副结核分枝杆菌感染晚期,ELISA方法的敏感性非常高[34]。

5.5 皮肤变态反应和γ干扰素释放试验 皮肤变态反应和γ干扰素释放试验等方法可用于副结核病的早期诊断,但是由于结核菌素具有高度特异性,易受其他结核杆菌的影响而造成假阳性[35]。因此,采用这2种方法较难准确判断副结核分枝杆菌的感染。

综上所述,在牛的不同生长阶段中,育成阶段牛副结核病的诊断最为困难。因为育成牛在长期的亚临床阶段,细胞免疫应答和体液免疫应答可能均不明显,且排菌量较低,因缺少理想的检测方法,可考虑采用皮肤变态反应和γ干扰素释放试验,结合抗体检测和细菌分离培养的方法进行检测[33]。2岁以上的患牛大都已进入体液免疫阶段,此时病牛持续感染排菌,临床上可采用ELISA和qPCR方法进行检测。

6 牛副结核病的防控

人类研究牛副结核病的历史已经超过百年,但是仍然没有特效的治疗和防控措施。当病畜进入感染晚期,临床症状明显,生产性能下降,抗体水平升高。虽然此时易于诊断,但是长期腹泻可能已经造成副结核分枝杆菌的大量污染。因此,改善牛场环境卫生,尤其是避免犊牛的感染,结合检测—剔除方法,是控制该病传播的主要措施[21]。防止犊牛摄入含有副结核分枝杆菌的成年牛乳汁和粪便,可以有效降低该病的扩散[36]。由于副结核病可以通过胎盘屏障垂直传播,所以已感染母畜的新生犊牛应当隔离饲养,最好及时进行检测并淘汰[36]。在副结核病高度流行的地区,每年应对牛群进行3～4次检测,及时淘汰阳性牛,避免造成更大的损失;对于疑似感染的牛,应严格隔离饲养,3个月后应再次检测[13]。

为了降低扑杀和淘汰病畜造成的巨大损失,部分欧美国家对新生犊牛进行疫苗接种。英国和部分东欧国家使用减毒活疫苗,美国和挪威等国家使用灭活疫苗[37]。但是,由于犊牛对副结核分枝杆菌易感,并存在垂直传播的风险,疫苗的保护效果受到质疑。同时,接种疫苗会影响临床上对牛结核病的诊断[36]。所以利用疫苗控制副结核病的方法没有在全球推广。

7 总结与展望

牛副结核病给养殖业以及乳品和牛肉的生产都造成了巨大的损失。该病造成的经济损失难以估算,其中不仅包括病牛淘汰的成本,还包括因饲料利用率低、生产性能差而导致的隐形损失和浪费的机会成本。对于副结核病感染早期的动物免疫机制的相关研究较少,对于该病的认识尚停留在浅层,且牛副结核病难以诊断,大量潜伏期的病畜可能无法确诊,导致其流行率被低估。研究认为,即使最敏感的分子检测技术也只能检测到25%～30%的受感染动物。因此,亟需改进现有的诊断方法,特别是鉴别诊断方法。目前,对于牛副结核病缺乏有效的防治手段,良好的管理和及时的检测成为最有效的防控措施。加强生物安全管理,有效实现控制净化,研发快速准确的检测方法,是防控牛副结核病的重要方向。