长沙生态动物园野生动物衣原体感染情况调查

张 林,曾光哲,王 文,张卫忠,邱启官,尹 崇,胡仕凤

(1. 湖南农业大学动物医学院,湖南 长沙 410128 ; 2. 株洲市动物疫病预防控制中心,湖南 株洲 412007 ; 3. 长沙生态动物园,湖南 长沙 410004)

衣原体(Chlamydia)是一种介于细菌和病毒之间的专性细胞内寄生微生物,具有独特的双相发育周期,是重要的人兽共患病原体。衣原体宿主极其广泛,包括人、各种哺乳动物和禽鸟类[1]。病原体主要随鼻、眼等的分泌物和排泄物排出体外,污染环境,经呼吸道、消化道、泌尿生殖道甚至损伤的皮肤黏膜感染,在哺乳动物和禽鸟类之间、哺乳动物和哺乳动物之间以及禽鸟类和禽鸟类之间互相传播[2]。人类感染衣原体可导致失明、流产、肠炎和肺炎等多种病症,鹦鹉热衣原体感染甚至可导致人死亡[3]。动物园动物种类繁多,人流量大(特别是节假日),在有限的空间里面,人与动物必然有直接或间接的接触,存在较大的染病风险。因此,了解衣原体在长沙生态动物园野生动物中的感染情况尤其重要,可为尽早采取有效防控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品的采集 在长沙生态动物园园区内,共采集了共计63种动物的231份新鲜粪便样品(表1),低温运送至实验室后,-20 ℃冻存备用。

表1 野生动物衣原体的PCR检测结果Table 1 PCR detection results of Chlamydia in wild animals

1.1.2 引物设计 根据中华人民共和国农业行业标准《动物衣原体病诊断技术》(NY/T 562—2015)[4]设计引物,用于扩增衣原体外膜蛋白A(Outer membrane protein A,ompA)基因片段,ompA基因片段具有4个相对保守区,可用于衣原体的鉴别诊断。第一次扩增引物:MP1:5′-ATGAAAAAAC-TCTTGAAATCGG-3′,MP2:5′-TTAGAATCTGAATTGAGCATTCAT-3′;第二次扩增引物:MP3:5′-CAGGATACTACGGAGATTATGTTT-3′,MP4:5-GATTAGA-TTGAGCGTATTGGAA-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,二扩目的片段大小为480 bp。

1.1.3 阳性对照 阳性对照1为根据衣原体ompA基因合成的阳性质粒,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;阳性对照2为猪衣原体DNA(与P1309株相似度为99%),由本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 样品DNA制备 按粪便DNA 提取试剂盒(天根)使用说明书操作提取基因组总DNA,作为PCR反应的模板。

1.2.2 PCR检测 巢式PCR反应体系采取25 μL体系,第一次扩增体系为1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL,MP1 0.5 μL,MP2 0.5 μL,模板(被检样品总DNA)2 μL;第二次扩增体系为1.1×T3 Super PCR Mix 23 μL,MP3 0.5 μL,MP4 0.5 μL,模板(第一次扩增产物) 1 μL。PCR反应条件参考《动物衣原体病诊断技术》(NY/T 562—2015)[4]。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 测序和序列分析 将第二次扩增阳性产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序,测序结果用DNASTAR软件进行拼接分析,在NCBI中BLAST进行同源性比对,使用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

2 结果

2.1 PCR检测 根据《动物衣原体病诊断技术》(NY/T 562—2015)[4],利用巢式 PCR 方法对所采集63种动物的 231 份粪便样品进行检测,结果如表1所示,共检测出13份阳性样品(部分样品的PCR电泳结果如图1所示),分别是绿孔雀(1/18)、红绿金刚鹦鹉(1/3)、豚尾猴(1/1)、赤猴(2/6)、狒狒(1/2)、黑白疣猴(1/1)、长臂猿(1/4)、羚羊(2/3)、东北虎(1/12)和水豚(2/3)共10种动物,总阳性率为5.63%(13/231),其中植食类动物阳性率为11.43%(4/35)、灵长类动物阳性率为13.95%(6/43)、禽鸟类动物阳性率为3.13%(2/64)、肉食类动物阳性率为1.12%(1/89)(表2)。从动物种类来说,阳性动物种类占比15.87%(10/63),主要集中在灵长类动物,11种灵长类动物中有5种检出阳性,占比45.45%,其他类型动物均只有1～2种动物检出阳性(表2)。

图1 衣原体ompA基因的巢式PCR扩增Fig.1 Nested PCR amplification of ompA gene from ChlamydiaM:DL-2 000 DNA 相对分子质量标准; 2:绿孔雀样本; 1、3～10:其他动物样本; 11:阴性对照; 12～13:阳性对照M:DL-2 000 DNA Marker; 2:Sample of Pavo muticus; 1,3-10:Samples of other animals; 11:Negative control; 12-13:Positive control

表2 衣原体感染阳性率统计分析Table 2 Statistical analysis of Chlamydia infection positive rate

使用SPSS 22.0软件,将禽鸟类、灵长类、植食类和肉食类动物的PCR检测结果分别与其余各组之和进行统计学分析,结果如表2所示,在本次调查中,禽鸟类动物的优势比(Odds ratio,OR)=0.46<1、χ2=1.04,说明感染风险较低,但不具有统计学意义(P>0.05);灵长类动物的OR=4.19>1、χ2=6.90,说明感染风险极显著高于其他动物(P<0.01);植食类动物的OR=2.68>1、χ2=2.61,说明感染风险较高,但不具有统计学意义(P>0.05);肉食类动物的OR=0.12<1、χ2=5.53,说明感染风险显著低于其他动物(P<0.05)。

2.2 测序和序列分析 将第2次扩增阳性产物送北京擎科新业生物技术有限公司基因测序,仅以1份绿孔雀阳性样品中获得有效的衣原体序列,该衣原体序列已上传至GenBank,登录号为OK033359.1。

将测序结果使用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/网站进行对比发现,该序列与Chlamydiagallinacea(C.gallinacea)基因相似度在95%以上,其中与美国分离株c149(序列号:KY206900.1)相似度最高,为99.72%,因而可以确定该绿孔雀感染的衣原体应该是最近发现的1个衣原体新种——C.gallinacea。

下载国内外报道的14个C.gallinacea基因序列:KY206900.1(美国)、HE660104.1(法国)、KT203207.1(山东)、KT203208.1(山东)、KT203198.1(云南)、KT203199.1(云南)、KT203196.1(浙江)、KT203203.1(广东)、KT203205.1(广东)、KT203204.1(广东)、KT203202.1(广东)、KT203201.1(四川)、KT203200.1(四川)和KT203211.1(海南),使用MEGA 7.0软件构建系统进化树,结果如图2所示,从绿孔雀粪便样品中发现的C.gallinacea与美国发现的衣原体菌株(KY206900.1)处于同一分支,同时与我国山东的2株分离株(KT203207.1和KT203208.1)有着较近的亲缘关系,而与广东、四川、云南、浙江和海南等地报道的C.gallinacea亲缘关系相距较远。并且从进化时间上来说,这应该是1株进化较早的C.gallinacea。

图2 基于C.gallinacea ompA基因的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on ompA gene from C.gallinacea▲:本试验所得的分离株▲:The strain isolated in this study

3 讨论

本次在长沙生态动物园调查的共计63种动物的231份粪便样品中,共发现13份样品呈衣原体阳性,总阳性率为5.63%(13/231),相较于陈仁锋等[5]在福州市野生动物园通过血清学检测所得的衣原体感染率(24.42%,32/132)和Feng等[6]在云南省昆明市动物园通过TaqMan MGB探针荧光定量聚合酶链反应检测所得的鹦鹉热衣原体感染率(11.7%,7/60),本动物园野生动物衣原体的感染率相对较低。虽然本园样品采集和检测方法与上述两园存在差异,不具备很好的对比性,但长沙生态动物园为新建园区,2010年才建成投入使用,场馆设施均较新,日常消毒防疫工作比较到位,像衣原体这种自然疫源性传染病病原体存在较少,可能是感染率低的主要原因。

由于采样的限制,每种动物的样品采集量非常有限,许多样品都是孤样,导致部分动物的阳性率偏高,不具有代表性。但从动物大类来看,本次检测该园中感染风险最高的是灵长类动物,感染的动物种类(5/11)明显高于其他类动物。通过统计学分析可知,不同的动物种类是感染衣原体的风险因素之一,其中肉食类动物的感染风险较低,灵长类动物的感染风险显著高于本次调查的其他动物。可能是由于圈养肉食类动物的食物均来自经过严格检验的肉类,致使食源性衣原体感染率较低。在饲养管理方面,该园内灵长类动物的活动区与肉食类动物大小接近,但种群密度远大于肉食类动物,且灵长类动物个体之间的接触更为频繁,可能是导致感染率较高的原因之一。而灵长类动物的衣原体感染风险是否与亲缘关系的远近有关,是否对人类存在较大威胁,有待进一步研究。

本试验从绿孔雀粪便样品中检测到的衣原体是近年发现的衣原体新种C.gallinacea,这在国内动物园饲养的孔雀体内属首次发现,且该衣原体还处在C.gallinacea进化的较早时期。C.gallinacea于2014年由Sachse K 和Laroucau K等[7]发现并命名,当时所有的C.gallinacea菌株均来源于鸡,所以,目前国内部分文献将其译为家禽衣原体或禽衣原体[2,8-9]。但是,随着对该衣原体的深入研究,发现C.gallinacea不仅只感染家禽,Li 等[10]对我国11个省奶牛和肉牛中衣原体的调查结果显示,牛的C.gallinacea感染率为20.8%;Stokes 等[11-12]在澳大利亚的野生鸟类中也发现了该衣原体;Laroucau等[13]报道2008年法国一家禽屠宰场工人曾发生的不明原因非典型肺炎,后来也被证实与C.gallinacea感染鸡密切接触有关。这些研究表明,C.gallinacea不仅只流行于家禽,对其他动物(包括人类)也可造成感染,应引起重视。不过,有金凤等[2,14]对C.gallinacea的传播方式进行了研究,发现该种衣原体的传播途径主要为粪口传播和垂直传播,并不会经呼吸道传播。动物园饲养管理人员只要加强个人防护,搞好环境卫生,及时清除粪便;游客在动物园游玩时尽量避免与动物直接接触,不随意到处乱摸,即可降低感染风险。

衣原体病属于人兽共患病,而动物园野生动物属于保护动物,不能随意淘汰。因此,对于确诊感染衣原体的动物,动物园在做好环境消杀和动物隔离的同时,一定要及时选择敏感药物进行治疗,如四环素、强力霉素、土霉素、泰乐菌素和螺旋霉素等,同时还要考虑交替用药,防止出现耐药性。