环形泰勒虫亚端粒编码可变分泌蛋白家族部分基因的研究进展

李 志,刘军龙,张学勇,付 永,朵 红,郭志宏

(1. 青海大学 青海省畜牧兽医科学院 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室 青海省动物疫病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室,青海 西宁 810016 ; 2. 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室,甘肃 兰州 730046)

热带泰勒虫病(Tropical theileriosis)是由环形泰勒虫(Theileriaannulata)感染牛的淋巴细胞、红细胞引起动物发病的一种血液原虫病,主要临床症状为贫血、发热、黄疸和体表淋巴结肿胀,严重时可致死亡,该病的某些临床症状与人白血病的症状一样,如贫血、发热和淋巴结肿胀等[1]。热带泰勒虫病主要在热带和亚热带地区流行,给畜牧养殖业造成严重经济损失[2-8]。尽管环形泰勒虫基因组和蛋白组数据已解析,但近一半的基因功能仍未知[1,9-10]。前期研究发现,环形泰勒虫的某些分子,如环形泰勒虫表面蛋白(Theileriaannulatasurface protein,TaSP)[11]、环形泰勒虫裂殖体表面蛋白p104(Theileriaannulataschizont surface protein p104,Ta-p104)[12]和环形泰勒虫脯氨酰异构酶1(Theileriaannulataprolyl isomerase I,TaPIN1)[13]等通过劫持宿主细胞信号,影响宿主细胞转化[14-15]。因此,本文就环形泰勒虫亚端粒编码可变分泌蛋白(Subtelomere-encoded variable secreted protein,SVSP)家族基因结构、表达特征、功能和与宿主的相互作用等进行综述,以期为泰勒虫SVSP家族基因的深入研究和泰勒虫-宿主相互作用机制的解析提供参考。

1 SVSP家族基因结构和特点

1.1 SVSP家族基因序列特征 Baylis等运用酵母双杂交系统筛选小泰勒虫(Theileriaparva,T.parva)文库时,偶然发现了编码富含谷氨酰胺(Q)和脯氨酸(P)蛋白质的1个新基因家族的几个成员,其中大多数含有信号肽序列[16];并且这些蛋白不同于其他免疫多态性分子,因此又被称为QP蛋白[17]。随着环形泰勒虫和小泰勒虫基因组的解析(环形泰勒虫基因组大小为8.4 Mb,小泰勒虫基因组大小则是8.3 Mb;且2种虫体基因组均含有4条染色体)[18],确认上述基因是位于泰勒虫4条染色体的端粒相关区域的1个大而独特的家族的一部分。该基因家族最初被命名为亚端粒可变分泌蛋白(Subtelomeric variable secreted protein,SVSP)家族。鉴于该家族基因由端粒区域所编码,但SVSP并未定位于端粒区域,因此,该家族最终被命名为亚端粒编码可变分泌蛋白(Subtelomere-encoded variable secreted proteins,SVSP)家族[19]。在小泰勒虫中,SVSP家族成员有85个基因,而在环形泰勒虫中,该家族包含51个基因,并且该家族是这2种虫体中最大的基因家族[19-20]。环形泰勒虫中的51个SVSP家族基因以短阵列分布在每个亚端粒中,在着丝粒侧有1个5′-三磷酸腺苷结合盒(Adenosine 5′-triphosphate-binding cassette,ABC)转运蛋白,在端粒侧有1个 限制酶SfiI 亚端粒基因,SVSP家族基因结构含有1个外显子,其氨基酸序列通常由1个短的保守的 N 端区域(该区域多含有1个信号肽序列)、1个高度非结构化的富含QP的区域和1个保守的C端区域组成;与其他已知蛋白相比,泰勒虫的SVSP家族基因的C端具有显著差异性[20]。另外,富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)约10个氨基酸组成的结构域(又称PEST基序)和与泰勒虫高度相关(Frequently associated inTheileria,FAINT)结构域是这2种虫体中环形泰勒虫裂殖体AT-hook蛋白家族(Theileriaannulataschizont AT-hook protein family,TashAT)和 SVSP家族基因的典型特征;几乎所有SVSP家族分子均含有大约70个氨基酸的FAINT结构域,这是构成大裂殖体分泌组蛋白质的显著特征[20]。在小泰勒虫中发现一些SVSP分子具有核定位信号,分析表明小泰勒虫SVSP家族基因(TP03_0882)编码的蛋白含有607个氨基酸(Amino acids,aa)残基,其中1～21 aa为信号肽序列,2个FAINT结构域分别位于422～481 aa和520～579 aa,使用FoldIndex 软件进行预测发现,该分子N端序列是未折叠的,而其C端区域可能是折叠的[19]。在环形泰勒虫中,同样发现SVSP3(TA17545)和SVSP4(TA16045)也含有核定位信号序列[20]。分别对环形泰勒虫SVSP家族中的SVSP449(TA05575)、SVSP454(TA05550)和SVSP455(TA05545)进行分析发现,以上3个分子的N端均含有信号肽序列,依次位于1～21 aa、1～22 aa 和1～20 aa;只有SVSP449(TA05575)含有核定位信号序列,位于217～234 aa;生物信息学预测结果如图1和图2所示,SVSP454(TA05550)和SVSP455(TA05545)均含有FAINT结构域,分别位于354～432 aa和332～416 aa,并且SVSP455(TA05545)序列的193～210 aa是1个Tash-PEST基序,232～310 aa含有1个内部重复1(Internal repeat 1,RPT1)结构域[21-24],其基因结构特征如表1所示,包括SVSP家族基因所编码氨基酸的大小、是否含有信号肽序列、跨膜域、糖基磷脂酰肌醇锚定域、核定位信号、FAINT结构域和PEST基序。

表1 环形泰勒虫SVSP的重要结构特征Table 1 Important structural characteristics of Theileria annulata SVSP

图1 环形泰勒虫SVSP454的结构Fig.1 Structure of Theileria annulata SVSP454

图2 生物信息学分析鉴定的环形泰勒虫SVSP455的结构特征示意图Fig.2 Schematic representation of the structural features of Theileria annulata SVSP455 identified by bioinformatics analysis信号肽(红色):1～20 aa; Tash-PEST基序(蓝色):193～201 aa; 内部重复1结构域(紫色):232～310 aa; FAINT结构域(绿色):332～416 aaSignal peptide (red):1-20 aa; Tash-PEST motif (blue):193-210 aa; Internal repeat 1 (RPT1) domain (purple):232-310 aa; FAINT domain (green):332-416 aa

1.2 SVSP家族基因多样性特征 比较基因组学对T.annulata和T.parva基因组分析结果如表2所示。虫体分泌的蛋白可能表达于裂殖子阶段或者裂殖体阶段,并且表现出相对较高的种间非同义核苷酸与同义核苷酸的替换率(Substitution ratio of nonsynonymous nucleotides to synonymous nucleotides,dNdS)[20]。在许多其他病原(病毒、细菌和蠕虫等)中,抗原基因具有更高的dNdS,环形泰勒虫中编码分泌蛋白的基因更有可能在种间水平上处于正向选择状态[19]。环形泰勒虫裂殖子表面蛋白1(Theileriaannulatamerozoite surface protein 1,Tams1)等位基因多样性的正向选择归因于宿主免疫选择[25]。研究发现,环形泰勒虫和小泰勒虫的15个多基因家族dNdS中,SVSP、TashAT[26-27]、Tams1、小泰勒虫裂殖子表面蛋白1(Theileriaparvamerozoite surface protein 1,Tpms1)[25]、环形泰勒虫子孢子表面抗原(Theileriaannulatasporozoite surface antigen,TaSPAG)、环形泰勒虫重复(Theileriaannulatarepeat,Tar)和小泰勒虫重复(Theileriaparvarepeat,Tpr)基因家族 dNdS高于dNdS平均值(0.122 0);其中抗原基因dNdS为0.211,Tar/Tpr基因家族dNdS为0.223,而SVSP家族基因dNdS则较低;同样地,在其他原虫(如疟原虫和锥虫)中,半胱氨酸蛋白酶家族和1个假定的卤酸脱卤酶样水解酶家族基因的dNdS也高于其平均值[20]。如环形泰勒虫SVSP家族中4个分子SVSP1(TA16025)、SVSP2(TA17485)、SVSP3(TA17545)和SVSP4(TA16045)的dNdS均高于其平均值,即这4个分子的dNdS范围为0.179 6[SVSP3(TA17545)]～0.403 7[SVSP1(TA16025)][20],表明环形泰勒虫SVSP家族的分子在正向选择压力下,具有多个核苷酸替换、插入和缺失的特征。然而,在泰勒虫裂殖体表达的编码分泌蛋白的基因中,dNdS升高和正向选择的原因仍有待确定。利用相对同义密码子(Relative synonymous codon usage,RSCU)技术对环形泰勒虫裂殖体表达的含有信号肽序列,且是小泰勒虫直系同源物的基因进行分析,发现SVSP家族基因具有非典型密码子使用特征,且与其氨基酸组成无关[20]。SVSP家族基因中密码子偏倚性可能原因是:(1)最佳密码子使用,利于其氨基酸翻译选择[28];(2)提高SVSP蛋白合成或翻译控制,利于虫体在宿主细胞中的生存和增殖。等位基因测序分析发现,环形泰勒虫SVSP家族基因长度在核苷酸和氨基酸水平均有高度多样性,在其PEST降解基序位点具有高度变异性;综合分析发现,SVSP家族基因在其进化方式上是中立的[20]。通过McDonald-Kreitman对环形泰勒虫SVSP2(TA17485)和SVSP4(TA16045)的进化中和指数分析发现,SVSP2(TA17485)的中和指数为0.834,SVSP4(TA16045)的中和指数为0.754。因此,在大部分中性突变的情况下,SVSP家族基因似乎在环形泰勒虫种群中缺乏强纯化选择的情况下进化,其原因可能是不同进化压力所造成的,并且这些压力反映了SVSP家族基因所编码的蛋白质的功能特性不同。

表2 环形泰勒虫和小泰勒虫基因组特性的比较Table 2 Comparison of genome characteristics between Theileria annulata and Theileria parva

2 SVSP家族基因的表达特征

尽管环形泰勒虫和小泰勒虫SVSP家族基因具有上述特征,但虫体SVSP家族基因主要在虫体裂殖体阶段表达,并且大多数蛋白分泌至宿主细胞中[20,29]。研究发现,小泰勒虫SVSP家族基因的许多分子也在其裂殖体阶段进行转录[30]。更重要的是,在小泰勒虫转化的3种不同细胞系中,65% 以上的SVSP家族基因的转录本均有表达;并且具有相似表达水平的基因分布在8个亚端粒上,在特定位置没有聚集[19]。基序预测分析表明,大多数 SVSP 蛋白被分泌到虫体感染细胞的细胞质中,说明其可能在虫体与转化的宿主细胞相互作用中发挥功能。并且,这2种虫体的许多SVSP含有核定位信号序列,说明其可能定位于宿主细胞核中。小泰勒虫的TP03_0882基因编码的蛋白含有核定位信号,将其转染人骨肉瘤细胞(U2OS)后,该分子分布于细胞核中;但在小泰勒虫感染的细胞中,并未发现该分子在宿主细胞中的分布特征;而用抗TP03_0882基因所编码蛋白的大鼠抗体处理后,在小泰勒虫感染细胞中也未检测到该分子[19]。利用激光共聚焦技术,发现环形泰勒虫SVSP家族分子SVSP449(TA05575)、SVSP454(TA05550)和SVSP455(TA05545)在感染的细胞核和胞浆中均有分布,SVSP455(TA05545)分子在虫体裂殖体表面也有分布,表明该分子可能在虫体转化宿主细胞过程中发挥重要作用;同时,实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测发现,上述3个基因主要在环形泰勒虫的裂殖体阶段发生转录[21-24],说明其在虫体转化宿主细胞过程中可能发挥作用。

研究表明,在环形泰勒虫感染的细胞中,SVSP449(TA05575)分子的表达水平从第10代到第20代显著下降,然后从第20代到第165代再次增加[21],所以SVSP449(TA05575)可能具有转录后控制机制功能,例如体内选择性剪接,以进一步影响寄生虫的生长和存活[31],但其具体作用机制尚不清楚。

综上所述,虫体SVSP家族基因在其转化的宿主细胞中差异表达可能由以下几点引起:(1)个体动物背景,因泰勒虫可感染黄牛、水牛、奶牛和牦牛,每种动物的易感性、宿主免疫力和健康水平等因素不同;(2)虫体感染宿主细胞类型不同,尽管小泰勒虫和环形泰勒虫的基因组和蛋白组数据很相似,但是其感染宿主的细胞嗜性不同,前者可使宿主T细胞、B细胞和巨噬细胞发生转化;而后者却侵染宿主B细胞、树突状细胞和巨噬细胞;(3)寄生虫基因型差异,这可能是SVSP家族基因内拷贝之间差异表达的关键决定因素[19-20]。同时,对SVSP进行蛋白检测困难的可能原因之一是SVSP含有PEST基序,而此基序可靶向真核细胞蛋白质使其发生快速降解,从而导致SVSP降解,但是其具体降解机制尚不清楚。

3 SVSP与宿主相互作用研究

随着现代生物技术的发展,环形泰勒虫基因组和蛋白质组已解析,这为虫体与宿主细胞的相互作用研究提供了基础数据和研究模型。目前,已解析了一些虫体分子与宿主细胞蛋白的相互作用及其在宿主细胞永生化过程中的作用机制[32-33],但虫体SVSP是否与宿主细胞发生相互作用的研究相对较少。基序预测分析表明,大多数 SVSP被分泌到虫体感染细胞的细胞质中,说明其可能与宿主某些分子发生相互作用,进而发挥功能。同时,也发现一些SVSP含有核定位信号,说明其可能与细胞核中某些分子发生相互作用。研究表明,环形泰勒虫SVSP家族分子-SVSP449(TA05575)可与宿主细胞X-链接2-样RNA结合基序蛋白(RNA binding motif protein,X-linked 2-like,RBMX2-Like)发生相互作用[21-22],该蛋白通过剪接体参与mRNA剪接,恰好印证了环形泰勒虫中可能存在选择性剪切机制。虫体分子SVSP454(TA05550)与宿主卷曲螺旋域181蛋白(Coiled-coil domain 181,CCDC181)和线粒体核糖体蛋白L30(Mitochondrial ribosomal protein L30,MRPL30)均发生相互作用[23];同时证明SVSP455(TA05545)与宿主热休克蛋白60(Heat shock protein 60,HSP60)发生相互作用[24](表3)。截至目前,关于小泰勒虫SVSP与宿主相互作用的研究鲜有报道;同时,环形泰勒虫其他SVSP是否也与宿主细胞发生相互作用仍有待解析。

表3 与环形泰勒虫SVSP相互作用的宿主细胞蛋白的鉴定Table 3 Identification of Theileria annulata SVSP interacting with host cell proteins

4 SVSP的功能

许多病原微生物的亚端粒都存在基因家族,该基因家族可能在病原与宿主的相互作用过程中发挥作用[34],如锥虫变异表面糖蛋白(Variant surface glycoproteins,vsg)基因[35]、疟原虫变异抗原(Variation antigen,var)基因家族分子[36]和念珠菌黏附素(Epithelial adhesin,EPA)基因[37]分别通过与宿主分子相互作用,参与虫体的吸附、入侵和免疫逃逸过程。SVSP家族作为环形泰勒虫基因组中成员最多的基因家族,阐明其在虫体转化细胞过程中的功能将为虫体-宿主相互作用机制及泰勒虫致病机理的研究奠定坚实基础。目前已发现,Ta-p104与宿主末端结合蛋白1(Ending binding protein1,EB1)结合,进而调控微管动力学[12];而TaPIN1通过与宿主含F-box/WD重复域蛋白7(F-box/WD repeat-containing protein 7,FBW7)结合,进而维持宿主细胞的转化状态[13-14]。因泰勒虫中SVSP分子存在PEST基序和信号肽序列,表明这些分子可分泌至宿主细胞中,以短肽的形式递呈至主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(Major histocompatibility complex I,MHC I),进而参与免疫调节,但是尚未解析该家族基因是如何进行短肽呈递的[38]。并且研究已证明,在小泰勒虫中,细胞毒性 T 细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)识别MHC I类呈递肽在宿主保护性免疫中发挥重要作用,并且已在小泰勒虫T 细胞抗原中鉴定出1个SVSP 家族成员为其T细胞抗原[39]。尽管前期研究发现,环形泰勒虫SVSP家族分子可能参与免疫逃逸,但是其具体生物学功能尚未阐明[25]。有研究已鉴定出泰勒虫SVSP家族少数分子表达特征及其相互作用分子,且发现虫体SVSP455(TA05545)与宿主HSP60相互作用,进而调控宿主细胞凋亡,但其在宿主细胞转化过程中的功能并不清楚,如SVSP基因序列中所含的QP结构域、PEST基序和FAINT结构域等是否在细胞转化过程中发挥重要功能;虫体SVSP455(TA05545)的转录随着虫体感染细胞代次的升高而逐渐下调[24],表明该分子可能与虫体毒力紧密相关,但其具体作用仍需进一步探究。另外,许多SVSP分子含有核定位信号,表明虫体分泌的这些分子可能通过劫持宿主细胞信号,进而维持细胞永生化状态。同时,Tretina等研究发现,SVSP基因家族分子可能参与虫体入侵、免疫逃逸和宿主细胞转化[1]。因此,关于SVSP分子的功能亟需深入、系统研究,从而为泰勒虫致病机制的研究提供参考依据。

5 总结与展望

顶复门原虫,包括泰勒虫、疟原虫和锥虫等,可通过劫持宿主细胞信号,从而使其在胞内增殖和生存[40-41]。唯一独特的是,环形泰勒虫和小泰勒虫裂殖体感染宿主细胞后,可使宿主细胞发生永生化,因此这2种寄生虫被称为转化型泰勒虫。已有研究表明,虫体某些分子通过劫持宿主细胞信号进而影响细胞表型[42-43],本文总结了转化型泰勒虫SVSP家族基因特征,即进化中立、核苷酸序列高度插入和缺失以及非典型密码子使用;以及一些SVSP分子在感染细胞中的分布特征和SVSP分子与宿主细胞相互作用的相关研究进展,这将为泰勒虫其他SVSP分子,甚至虫体其他蛋白与宿主相互作用的机制研究提供参考,同时为泰勒虫诱导的细胞转化机制解析提供思路。但是仍有以下问题亟需探究:(1)什么因素造成SVSP家族基因多样性;(2)哪些原因造成SVSP家族基因在虫体感染细胞中的表达模式和特征差异,SVSP是在单个还是几个裂殖体核中表达;(3)SVSP与宿主细胞蛋白的相互作用机制研究;(4)SVSP分子通过什么策略影响细胞表型?对上述科学问题的解析,需利用癌症生物学研究的资源、技术和理论对其进行一一探究,这将为泰勒虫转化细胞机制研究提供参考,同时为靶标药物开发和疫苗研制提供支撑。