酪蛋白-金银合金纳米簇的制备及其对金霉素的荧光检测

张嘉伟,徐 凡,耿永康,曹 蕾,王佳茜,周梦艳,付丁伊*

(1.南通大学 杏林学院,江苏 南通 226236 ; 2.南通大学 药学院 ,江苏 南通 226001)

金霉素(CTC)是一种四环素类抗生素药物,具有很强的抗菌消炎作用,临床主要用于治疗细菌引起的感染性疾病等,但其毒副作用较大,使用不当易引起胃肠道紊乱和肝毒性等[1-3]。此外,CTC常被用作饲料添加剂,可促进生长、改善饲养效率,同时具有预防动物疾病、改善消化代谢、抑制有害微生物等作用[4-6]。然而,过量使用会导致CTC在农副产品中残留,这将严重威胁人类健康,导致不良的生理反应如过敏性反应,还会造成环境污染并引起细菌耐药性。目前常用的测定方法有高效液相色谱法、免疫层析法、化学发光法和微生物法等[7-10]。但这些方法操作繁琐,且易受杂质影响,抗干扰效果差[11]。因此,开发一种更加简便快捷的方法定量检测CTC具有重要意义。

近年来,金属纳米簇因其独特的荧光特性,在环境检测、细胞标记及成像等领域受到越来越多的关注,其中,蛋白质保护的金属纳米簇表现出优异的水溶性和荧光特性、光稳定性、低毒性等优点而被广泛使用[12-17]。酪蛋白作为一种含磷钙的结合蛋白,来源广泛,极易获取,且包含多个酪氨酸、色氨酸等还原性氨基酸,可以作为一种合成金属纳米簇的配体分子[18]。基于此,本研究以酪蛋白为保护剂和还原剂,通过一锅加热法优化制备金银合金纳米簇,并研究其对CTC的响应传感。

1 实验部分

1.1 实验仪器

水浴锅、漩涡震荡仪,中国群安实验仪器有限公司;RF-6000荧光光谱仪,日本岛津公司;UV-3600紫外可见吸收光谱仪,日本岛津公司;红外光谱仪,德国布鲁克公司;JEM-2200FS透射电镜,日本电子株式会社。

1.2 试剂材料

HAuCl4·3H2O,Aladdin试剂公司;AgNO3,分析纯,上海沪试生药集团化学试剂有限公司;盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸强力霉素,纯度≥98%,麦克林试剂公司;NaOH、ZnCl2、CaCl2、KCl、Na2CO3、KBr、Mg(NO3)2·6H2O,纯度≥98%,北京化工厂;亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸,纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司。

1.3 Au-AgNCs@casein的合成

向2 mL样品管中依次加入30 mg酪蛋白固体,750 μL的去离子水和50 μL浓度为3 mol/L的NaOH溶液,振荡摇匀后在70 ℃条件下加热20 min,再加入300 μL浓度为10 mmol/L的HAuCl4和50 μL浓度为10 mmol/L的AgNO3溶液,混合均匀,在70 ℃下加热3 h,得到淡黄色溶液,产物置于4 ℃冰箱保存。

1.4 Au-AgNCs@casein的表征

利用荧光分光光度计测量Au-AgNCs@casein的荧光图谱;使用紫外-可见光度计测量产物的紫外-可见吸收光谱(UV);使用透射电镜(TEM)对Au-AgNCs@casein的形貌进行表征,并根据电镜照片统计颗粒的尺寸大小分布。

1.5 Au-AgNCs@casein为荧光探针检测CTC

将Au-AgNCs@casein冻干粉溶于去离子水,最终浓度为100 mg/L。然后向系统体系中加入不同浓度的CTC,混合均匀后室温下孵育20 min,使用荧光光谱仪检测325 nm激发波长条件下产物的荧光发射光谱,同时在日光或手提紫外灯照射条件下,拍摄加入不同浓度CTC的Au-AgNCs@casein照片,得到不同浓度的CTC对Au-AgNCs@casein溶液及荧光强度的影响。

1.6 评价CTC检测的选择性和抗干扰能力

利用荧光光谱评价Au-AgNCs@casein探针对CTC传感的选择性和抗干扰能力,将Au-AgNCs@casein探针分别与盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸强力霉素在相同条件下孵育反应5 min,监测其荧光强度变化。在含有氨基酸,或含有Ca2+、K+、Br-、Mg2+等离子的条件下监测含/不含CTC的Au-AgNCs@casein的荧光发射强度。

2 结果和讨论

2.1 Au-AgNCs@casein的合成与表征

如前所述,使用NaOH溶液将酪蛋白进行蛋白变性处理后,与HAuCl4和AgNO3混合70 ℃加热反应3 h获得Au-AgNCs@casein的水溶液。利用TEM对所得产物的形貌和结构进行分析,结果如图1a所示,表明Au-AgNCs@casein接近球形,尺寸均一且单分散,粒径尺寸分布在1.5～4.5 nm,如图1b所示,平均粒径为2.7 nm,尺寸分布较窄。

图1 Au-AgNCs@casein的TEM图像及粒径分布统计图

2.2 荧光和紫外可见吸收光谱分析

优化合成条件后制备得到的Au-AgNCs@casein在325 nm的最佳激发波长下,在445、660 nm处有双荧光发射(图2a),斯托克斯位移达到345 nm,说明产物具有穿透性强、对生物样品的光损伤小、检测灵敏度高等优点。日光下观察该纳米簇溶液颜色呈淡黄色,而365 nm手提紫外灯照射下呈明亮的红色荧光(图2a)。利用紫外-可见吸收光谱对Au-AgNCs@casein进行表征,结果如图2b所示,在300～800 nm处没有产生明显的吸收峰,证明溶液中没有形成具有等离子体吸收的大型纳米粒子,而是以小尺寸的纳米簇形式存在。

图2 Au-AgNCs@casein的荧光光谱和紫外可见吸收光谱

2.3 以Au-AgNCs@casein为荧光探针检测CTC

将不同浓度的CTC逐渐加入到Au-AgNCs@casein的溶液中,445 nm处的荧光强度逐渐增强,而660 nm处的荧光强度保持不变(图3a),当CTC浓度达到5.5 μmol/L时,Au-AgNCs@casein的荧光发射峰强度达到最大。通过分析可知,产物的荧光强度与CTC的浓度(0～5.5 μmol/L)呈现良好的线性关系(图3b)。

图3 加入CTC后Au-AgNCs@casein的荧光发射光谱

向各Au-AgNCs@casein样品中加入不同浓度的CTC,在日光和手提紫外灯光照射下分别拍摄照片见图4。

图4 不同浓度CTC加入Au-AgNCs@casein溶液后产物的照片

日光下添加了不同浓度CTC的Au-AgNCs@casein颜色没有明显的变化(图4a),而在手提紫外灯光照射下,随着检测的CTC浓度逐渐升高,溶液颜色由红色渐渐变为粉紫色(图4b)。结合CTC浓度与荧光强度的线性关系结果可以说明,Au-AgNCs@casein可以作为一种有效且灵敏的比率型荧光探针,用于定量检测CTC。

2.4 Au-AgNCs@casein检测CTC的选择性

在不改变反应条件的前提下,用相同的方法分别检测其他四环素类抗生素(TCs,如盐酸土霉素、盐酸强力霉素和盐酸四环素)对Au-AgNCs@casein荧光强度的影响(图5)。

图5 加入不同四环素类药物后Au-AgNCs@casein在420 nm与650 nm处荧光强度比

结果表明,CTC可以使Au-AgNCs@casein在445 nm处的荧光明显增强,而其余的抗生素对其影响相对较小,这充分说明Au-AgNCs@casein可以作为荧光探针灵敏、特异地检测CTC。

2.5 Au-AgNCs@casein检测CTC的抗干扰能力评价

由图6a和6b可以看出,这些干扰因子对Au-AgNCs@casein本身稍有影响,但对于CTC的检测几乎没有影响,说明Au-AgNCs@casein的抗干扰能力较强。

图6 加入干扰物后Au-AgNCs@casein的荧光发射光谱

3 结论

以酪蛋白为配体,使用一锅法成功合成了酪蛋白保护的金银合金纳米簇,合成方法简单、易操作、成本低廉。该纳米簇在325 nm激发波长条件下,在445 nm和660 nm处有双荧光发射,可以作为一种新型的比率型荧光探针高效、高灵敏度和特异性检测溶液中的CTC,且具有良好的选择性和抗干扰能力。基于Au-AgNCs@casein易于合成且拥有良好的发光性等优秀特性,为开发廉价、灵敏的生物和环境探针提供新策略,同时为CTC的快速特异性检验提供新的材料和思路。