夏枯草多倍体的诱导与鉴定

齐琳琳，温春秀，刘灵娣，姜涛

（河北省农林科学院经济作物研究所/ 河北省药用植物工程技术研究中心，河北 石家庄 050051）

夏枯草（Prunella vulgarisL.）为唇形科夏枯草的干燥果穗[1]，又名夏枯球、棒柱头花、六月干，因“此草夏至后即枯”而得名[2]，是常用的传统中药材之一，具有很高的药用价值[3]，其干燥果穗具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效[4，5]，还具有降糖、降压、免疫调节、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理作用[6]，用于治疗目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕等症[7]。夏枯草产地分布于全国各地[8]，主产区为江苏、安徽、浙江、河南等，其中河南省桐柏县所产最优[9]。

药用植物多倍体由于染色体加倍，一般表现为植株矮壮、茎粗、叶宽厚、色深、花大、果实大、种子大而少等[10]。器官的增大提高了以相应部位入药的药材产量。四倍体黄芩株型紧凑，叶片大且厚，生长势旺，适应性强，产量较普通二倍体黄芩高52.5%[11]。四倍体金银花“九丰一号”较二倍体增产58.7%[12]。同时，药用植物在诱导加倍后，往往能提高体内所含药用活性成分的含量[13]。潘平等[14]对多倍体（十六倍体）半夏与八倍体半夏原球茎中的草酸钙晶体含量进行比较后发现，多倍体中的草酸钙含量是单倍体的1倍以上。温春秀等[15]利用秋水仙素处理二倍体紫苏幼苗生长点，选育出四倍体紫苏新品种“多紫2 号”，其叶片挥发油含量达到0.79%，茎中迷迭香酸含量达1.34%，药用成分含量明显高于二倍体紫苏。夏枯草由于具有重要的药用价值和广泛的药理作用，越来越受到人们的关注。因此，诱导夏枯草染色体加倍，培育夏枯草优良多倍体株系具有重要意义。

多年来，国内外学者对夏枯草进行了广泛研究，尤其是在化学成分和药理作用方面进行了较为深入的探讨[16]。但截至目前，针对夏枯草种质资源倍性的系统研究尚未见报道。本研究采用秋水仙素处理植株生长点诱导染色体加倍的方法，通过流式细胞术和根尖染色体鉴定获得了5 个夏枯草多倍体株系，为新品种选育提供了种质材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物试材为河北省农林科学院经济作物研究所药用植物研究中心用夏枯草种子繁育的幼苗。

试验仪器主要有D3024R 赛洛捷克离心机（广州硕谱生物科技有限公司）、CytoFLEX 流式细胞仪（贝克曼库尔特）、BCD-315TNGS 冰箱（青岛海尔股份有限公司）、B-260 恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）、Nikon E100 显微镜（广州市明美光电技术有限公司）、Waters2695-2998 高效液相色谱仪（杭州瑞析科技有限公司）、PR124ZHZ 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）、数显游标卡尺（桂林量具有限责任公司）和FW100 高速粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

试剂主要有秋水仙素（源叶生物，生物技术级，含量98%）、DAPI 染色液（北京博奥拓达科技有限公司，1 mg/mL）、RNA 酶（北京博奥拓达科技有限公司，活性＞50～100 U/mg）、无水乙醇（天津市优谱化学试剂有限公司，分析纯）、冰乙酸（天津市光复科技发展有限公司，含量99.5%）、盐酸（北京化工厂，分析纯）、改良石碳酸复红染色液（北京索莱宝科技有限公司）、Tris-HCl 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，1 mol/L，pH 值7.5）、KCL（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）、NaCl（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）、EDTA-Na2（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）、C2H6OS（北京索莱宝科技有限公司，纯度≥99.0%）和TritonX-100（北京索莱宝科技有限公司，分析纯）。

1.2 试验方法

采用秋水仙素处理幼苗生长点的方法，诱导夏枯草多倍体的产生；通过植株形态学观察、流式细胞术鉴定、根尖染色体鉴定对其变异株进行倍性鉴定，并对不同浓度与处理时间的植株诱变效果进行比较；对大田生长的变异株与对照植株的迷迭香酸含量进行比较。

1.2.1 多倍体植株诱导 夏枯草幼苗长出第2 对真叶时，将脱脂棉球用秋水仙素溶液湿透后贴敷在幼苗生长点上进行诱导处理，试验秋水仙素浓度设0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%计5 个处理；以后每天9：00 和16：00 均在棉球上滴1 次相应处理浓度的秋水仙素溶液，使棉球湿透，分别在处理后的第3、第4 和第5 天去掉棉球。以不添加秋水仙素处理为对照（CK）。每处理100 株幼苗，3 次重复。去掉棉球2 周后，观察并记录夏枯草幼苗的成活数量。计算幼苗死亡率。

1.2.2 多倍体植株鉴定 多倍体植株鉴定程序为：采用植株形态学鉴定法筛选目标植株—采用流式细胞术鉴定法初步得到变异植株—采用根尖染色体鉴定法对变异植株进行明确。

1.2.2.1 植株形态学鉴定。将秋水仙素处理后长出新芽的夏枯草植株与对照植株进行比较，依据叶片变厚、叶色变绿、叶片皱缩、植株生长缓慢等多倍体植株的形态学特点，筛选目标植株。记录目标植株的数量。

1.2.2.2 流式细胞术鉴定。取夏枯草待检测植株第2对真叶以上的幼嫩叶片1 cm2置于培养皿中，加提取缓冲液（按表1 配方取各成分，加去离子水至1 000 mL，pH 值7.5，用300 目尼龙网过滤2 遍，4℃储存）1.5mL，用锋利的刀片将叶片迅速垂直切碎，然后用300 目滤网过滤到1.5mL 离心管中，得到细胞悬浮液；1000r/min离心3 min，倒出上清液，向管中分别加入提取缓冲液和DAPI 染液（染液中加入适量RNA 酶，排除双链RNA 的干扰，浓度为50 μg/mL）各50 μL，混匀后避光染色1 min，利用流式细胞仪对植株倍性进行初步检测，荧光通道选择PB450-A。记录变异植株的编号和数量。

表1 提取缓冲液的配方Table 1 Formula of extracting buffer

1.2.2.3 根尖染色体鉴定。将变异株系和对照株系的幼苗移栽入试验田，在相同条件下培养。待植株成熟收获果穗后，取其种子进行催芽，采用压片法进行根尖染色体检测。选择夏枯草幼根根尖分裂最活跃的时期（8：00～11：00）取其根尖1 cm 左右，置于冰水混合物中于4 ℃冰箱中预处理24 h。用卡诺固定液〔V（95%乙醇）：V（冰醋酸）＝3 ∶1〕处理24 h，流动水洗2～3 次；在1 mol/L 的稀盐酸中解离，60 ℃恒温水浴5 min 左右，流动水洗2～3 次。吸干根表面的水分后切取长1～3 mm 的分生组织，用改良石碳酸复红染色液染色20 min 左右，压片。使用Nikon E100 光学显微镜镜检、拍照，观察染色体数目。变异植株的染色体数目较对照植株染色体数目成倍增加的，即确定为多倍体植株。记录多倍体植株的编号和数量。计算诱导率（变异植株数量/目标植株数量×100%）。

1.2.3 多倍体植株的选育 通过农艺性状比较和药用成分含量分析，进行夏枯草多倍体植株的选育。

1.2.3.1 农艺性状调查。经鉴定为多倍体的株系，育苗后移栽入试验田，进行连续多年的田间筛选鉴定。6 月下旬夏枯草开花期，用直尺测量叶片大小，用游标卡尺测量花冠大小，用电子天平称量4 cm2叶片的重量（表示叶片厚度）；10 月下旬植株成熟收获果穗后，用游标卡尺测量果穗和种子的大小，用电子天平称量1 000 粒种子的重量。选育出多倍体性状特征明显、农艺性状较好的株系进一步扩大繁殖，以便进行品种比较试验和示范推广应用。

1.2.3.2 药用成分含量分析。移入田间的多倍体植株和对照植株果穗采收后，用高速粉碎机磨成粉状，采用高效液相色谱法[5]测定迷迭香酸含量。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素不同浓度与时长处理的夏枯草诱导效果

秋水仙素不同浓度与时长处理的夏枯草幼苗存活数和突变数差异较大，其中0.05%秋水仙素处理诱导夏枯草染色体加倍的成功率较高，且致死率低；该浓度下，处理时长4 d 的效果最好，致死率为46.00%，诱导率为16.00%（表2）。

表2 秋水仙素不同浓度与时长处理的诱导效果Table 2 Induction effects of colchicine with different concentrations and duration

2.2 四倍体夏枯草的鉴定

2.2.1 流式细胞术鉴定 该鉴定法制样简单、灵敏度高、分辨率高、准确性好，且数据的可重复性好、测试速度快、植物损伤性小，目前已成为倍性鉴定的主要方法，尤其适合大量样品的染色体倍性分析[7]。流式细胞术鉴定结果（图1）显示，对照植株的二倍体峰值处于30×104道附近；四倍体植株的四倍体峰值处于60×104道左右，约为对照的2 倍。可以看出，峰值出现与染色体倍性关系准确。

图1 流式细胞仪检测结果Fig.1 Results of flow cytometry

2.2.2 根尖染色体鉴定 根尖染色体鉴定结果（图2）显示，夏枯草二倍体植株的根尖染色体数目为2n=2x=28；四倍体植株的根尖染色体数目为2n=4x=56，增加了1 倍。可以看出，四倍体植株的根尖染色体数目明显多于二倍体植株。

图2 根尖染色体数目鉴定结果Fig.2 Identification results of root tip chromosomes

2.3 四倍体夏枯草的选育

2.3.1 四倍体夏枯草的田间农艺性状 四倍体夏枯草植株的各农艺性状与二倍体植株相比均发生了明显变化（表3），田间表现为叶片厚大、叶片泡皱程度较强（图3）、果穗短粗（图4）、种子明显较大（图5）。

图3 二倍体与四倍体夏枯草的叶片比较Fig.3 Comparison of leaf between diploid and tetraploid P.vulgaris

图4 二倍体与四倍体夏枯草的果穗比较Fig.4 Comparison of ear between diploid and tetraploid P.vulgaris

图5 二倍体与四倍体夏枯草的种子比较Fig.5 Comparison of seed between diploid and tetraploid P.vulgaris

表3 二倍体与四倍体夏枯草的农艺性状比较Table 3 Comparison of agronomic characters between diploid and tetraploid P.vulgaris

2.3.2 四倍体夏枯草的药用成分含量 依据《中国药典》对四倍体夏枯草株系的迷迭香酸含量进行检测，结果（图6）显示，四倍体植株的迷迭香酸含量高于二倍体株系，且明显高于《中国药典》 含量标准（0.020%），最高含量达到2.23%。

图6 二倍体与四倍体夏枯草迷迭香酸含量的比较Fig.6 Comparison of rosmarinic acid content between diploid and tetraploid P.vulgaris

3 结论与讨论

自然界多倍体虽然分布广泛，但数量有限[17]，因此，需要采用人工诱导的方法获得多倍体品种。目前在多倍体育种中，秋水仙素是应用较为广泛的化学试剂之一[18]。本研究利用秋水仙素作为诱变剂，对夏枯草幼苗生长点进行了不同浓度和时长处理，以诱导率高且致死率低为目标，对秋水仙素溶液处理的适宜浓度和时长进行筛选，结果表明，秋水仙素溶液处理的最佳浓度为0.05%、最佳时长为4 d，该条件下多倍体诱导率最高达到16.00%、致死率最低为46.00%。经农艺性状调查和药用成分含量检测，得到四倍体夏枯草优良株系5 个，分别为X33-35、X88-67、X39-31、X12-2 和X88-37。与二倍体植株相比，四倍体植株叶片厚大、皱缩，叶色浓绿，果穗短粗，种子大且饱满，药用成分含量高，为新品种选育提供了种质材料。

本试验获得的夏枯草多倍体植株，将开展多年连续单株收种、株行种植，并进行田间性状观察，以获得稳定的多倍体株系；同时，对稳定株系开展生物学特性、农艺性状、营养成分及药用成分等方面的比较分析，以产量和药用成分含量作为核心选育目标，以期选育出优良的多倍体新品系。