硅烷化银涂层钛植入物的抗菌改性研究*

赵 波,马凤仓,何代华,侯中中

(上海理工大学 材料与化学学院,上海 200093)

0 引言

钛及其合金主要包括Ti6Al4V和TiNb,其具有良好的生物相容性、机械性能和耐腐蚀性能,有较强的临床应用潜力[1-6]。生物相容性是指一种材料与细胞和组织保持和谐的能力。当一种生物相容性材料被植入体内时,将不会产生炎症和免疫问题,容易被身体接受。影响生物相容性的因素主要有:合成植入物与周围组织的相互作用、材料留在体内的时间、材料的类型、合成植入物的形状和大小等[7-13]。

目前,大量研究集中于评估钛与周围细胞之间的相互作用上。在人造钛被植入后,各类相互作用被触发,释放出各种信号,导致细胞附着,附着的细胞可能是单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。人工髋关节、膝关节和种植牙是微生物定植和生物膜形成的有利基质,在此处,宿主细胞和微生物竞相占据植入物表面的更高部分,即所谓的“争夺表面”。为了保证植入过程的成功并延长其有效寿命,提供预防生物膜形成的策略是至关重要的[14-18]。

与种植体相关的感染是最常见和最严重的术后并发症之一,因此种植体材料的抗菌性能非常重要,有两种方法可以解决这个问题:其一是通过加入非金属材料对钛表面进行修饰,如抗生素或具有抗菌性能的聚合物等;其二是通过加入抗菌金属对钛表面进行修饰。金属纳米颗粒现已被广泛应用于材料科学、化学和医学等领域。

Ag、Zn和Mg是优秀的无机抗菌剂[19-24]。此外,Ag具有阻止人类免疫缺陷病毒(HIV)与宿主细胞结合的能力。纳米银比微米银具有更大的表面积,因此其抗菌性能优于微米银。在金属植入物上沉积纳米银层的技术有溶胶-凝胶、磁控溅射[25]和电沉积[26]等。此外,还可借助表面改性或预处理方法,在金属基底上形成银纳米颗粒层。硅烷化是一种具有成本效益的工艺,在表面形成共价结合的硅烷单层,使顶部Ag层和底层基底之间形成接枝界面,这种方法可以显著增加银纳米颗粒在表面的沉积数量[27-29]。

针对钛植入物植入早期易被细菌感染的隐患,本文通过酸蚀和碱热在钛表面构建微纳米网状结构,通过硝酸银和柠檬酸三钠合成纳米银颗粒、硅烷改性纳米银液浸泡等步骤构建抗菌表面,并对钛片表面的物理化学性能和抗菌性能进行研究,以期为钛种植体的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

钛片(高纯金属材料研究所),APTES,NaOH,HF,丙酮,无水乙醇,无菌定性滤纸,PBS,CCK-8试剂盒,细菌培养板,硝酸银,柠檬酸三钠,pH试纸,硼氢化钠,培养基(中国医药集团有限公司),大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,成骨细胞(上海保藏生物技术中心总店),扫描电镜(Zeiss Sigma 300),管式炉(南京博蕴通仪器科技有限公司),场发射环境扫描电子显微镜(TESCAN VEGA3),JC2000C1界面张力测量仪(上海中晨数字技术设备有限公司),Lambda 750 紫外/可见/近红外光谱仪(Perkin Elmer)。

1.2 涂层制备方法

采用Ⅰ级商用纯钛圆片,直径10 mm,厚1 mm;使用SiC金刚砂机械研磨纸张砂砾达到2 000目,然后用1 μm金刚石膏抛光,以获得镜面般的表面光洁度。随后,将圆片放在丙酮、乙醇和蒸馏水介质中进行10 min的超声清洗。对该样品进行两步表面改性,具体步骤如下:

a.在室温下,先将预处理后的样品放入1.5% HF中蚀刻10 min,再将样品浸泡在60 ℃、5 mol/L NaOH溶液中水浴处理24 h,用去离子水冲洗,并在干氮气流下干燥;在600 ℃下保温1 h,制备出表面具有微纳米结构的钛片。

b.经化学蚀刻后的钛片在5%的3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)溶液中以乙醇为溶剂分别硅烷化2、4、6 h。硅烷化样品在乙醇溶液中超声清洗,然后用蒸馏水冲洗,在氮气气流中干燥。同时将钛片分成6组:机械抛光组(NT)、喷砂酸蚀组(AT)、碱热组(OH)、酸蚀碱热硅烷化2 h组(OHJ2)、酸蚀碱热硅烷化4 h组(OHJ4)和酸蚀碱热硅烷化6 h组(OHJ6)。

1.3 含AgNPs层的沉积

为了制备含AgNPs层的沉积电解质,在100 mL去离子水中加入0.12 mmol/L AgNO3和柠檬酸三钠。电解液制备在300 r/min的磁搅拌速率下进行。当得到均匀的悬浮液时,将0.3 mmol/L NaBH4加入配制好的溶液中;然后将经过预处理的样品浸入终液中3 h,使其表面形成含Ag层。最后,用清水冲洗Ag涂层基材,并在室温下的氮气气流中干燥。

1.4 抗菌实验

选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行材料抗菌实验。将硅烷化处理2、4、6 h载银钛片分为3组,各静置在PBS溶液中24 h,同时配制若干无菌定性滤纸盘(直径6 mm),留出空白对照组,然后将其余组浸泡在已经静置24 h的钛片PBS溶液中15 min,重复3次,最后将滤纸盘用高压蒸汽锅灭菌,干燥。用6 g蛋白胨、3 g酵母提取物、6 g NaCl、16 g琼脂和600 mL蒸馏水制备液体培养基。用6 mol/L氢氧化钠溶液调节液体培养基pH为7.2～7.4,然后置于高压蒸汽灭菌锅中,在120 ℃下灭菌30 min,取出冷却,得到固体培养基并将两种菌种均匀涂覆在培养基上,然后将不同处理组的滤纸盘分别粘贴到固体培养基上,再将每个培养基放置在37 ℃恒温培养箱中孵育24 h,观察抑菌圈的生长情况。

1.5 细胞培养

将每毫升密度为1×106的成骨细胞加入添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素抗生素溶液的培养基中, 在95%的空气及5%的CO2湿润培养箱中于37 ℃下培养48 h,使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液,从培养基中除去未附着的细胞。每2 d更换一次培养基,培养5 d,再用MTT法检测细胞增殖状况。医用植入材料植入人体后需要具备良好的生物相容性和骨结合能力,故对植入材料表面成骨细胞黏附增殖情况进行初步分析,以判定植入物材料是否具备良好的生物活性。细胞增殖指数(ICP)的计算公式为

(1)

2 结果与讨论

2.1 表面形貌

经机械抛光和喷砂酸蚀以及酸蚀碱热后的3种钛片表面扫描形貌见图1。由图1可知,在图1(a)中经机械抛光的钛片表面是一个光滑的平面,图1(b)中经喷砂酸蚀后的钛片表面形成了许多微米级的小凹坑,且部分凹坑有连接成网状的趋势,在图1(c)中经酸蚀碱热处理的钛片表面形成了均匀分布的海绵状三维立体网状结构,这种网状结构能极大提升钛片的生物活性及骨结合能力,且经过酸蚀碱热后的钛片,氧含量会比未经过碱热处理后的钛片高,可以增强钛片表面的粗糙度和润湿性。粗糙的表面增大了表面积和能量,从而提供了更多的非均相成核位点,能促进AgNPs层的沉积。

图1 扫描电镜下经酸碱处理和机械处理后钛片的表面形貌Fig.1 Surface morphology of the titanium sheet after acid-alkali treatment and mechanical treatment under scanning electron microscope

2.2 表面润湿性能

改性后钛片的亲水性和粗糙度是影响材料生物学特性的关键参数。网状表面的产生提高了材料的粗糙度和亲水性,且此时细菌细胞壁的刚性结构不够灵活,无法适应多孔网状表面[30-31],可以有效防止细菌附着在材料上。图2是改性后钛表面的亲水性变化。根据接触角测量结果,经机械抛光后的钛片接触角超过90°,是非亲水性表面,不利于细胞黏附。经喷砂酸蚀后的钛片开始具有亲水性,表面微孔结构使接触角有一定程度的减小。经酸蚀碱热处理后的多孔网状结构使接触角显著减小,呈现出极亲水的状态,有利于细胞黏附。而在进一步硅烷化处理后,钛表面形成了具有共价结合的硅烷单层,导致了各组水接触角均有不同程度的增大。

图2 钛表面经机械抛光(NT)、喷砂酸蚀(AT)、酸蚀碱热(OH)处理后硅烷化2、4、6 h的表面润湿性变化Fig 2 Surface wettability changes of titanium surface after mechanical polishing (NT),sand blasting and acid etching (AT),acid etching and alkali heat (OH) treatment for 2,4 and 6 hours of silanization

2.3 表面硅烷化

3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)表面硅烷化是一种用烷氧基硅烷分子使表面功能化的过程。在预处理后的钛表面形成共价结合的硅烷单层,从而使沉积的Ag层和底层钛基底之间形成接枝界面。此外,APTES溶剂可以提高Si的含量和增加分散质量。图3是钛预处理后硅烷化表面的EDS元素映射显微图。由图3可知,随着硅烷化时间的增加,钛表面上Si含量升高,同时Si元素在整个表面分布更加均匀。由此推断出,硅烷化过程中改变硅烷化时间可以显著影响Si的含量,而Si是基板与金属氧化物之间的附着剂,相对应的沉积银纳米粒子也会增加。

图3 硅烷化2、4、6 h后钛片表面的EDS元素映射显微图Fig.3 EDS elemental mapping micrographs of the surface of the titanium sheet after silanization for 2,4 and 6 hours

2.4 银纳米粒子合成

在由硝酸银、柠檬酸三钠和硼氢化钠组成的电解液中,可以在蚀刻的硅烷钛片上形成含AgNPs的层,反应式如下:

3AgNO3+C6H5O7Na3→3Ag+C6H5O7+3NaNO3,

(2)

2AgNO3+2NaBH4→2Ag+H2+B2H6+2NaNO3。

(3)

式(2)是从盐中减少银,式(3)是在银核周围形成一层银,以限制纳米颗粒的形状和大小。可以通过改变还原剂和盖层剂的浓度来控制沉积颗粒的成核和生长速率。图4是制备的银纳米粒子的紫外-可见光谱图。由图4可知,AgNPs的最大吸收波长为420 nm,这与文献[32]中的结论一致。

图4 银纳米粒子的紫外-可见光谱图Fig.4 UV-Vis spectrum of silver nanoparticles

此外,将硅烷化不同时间的钛片浸入相同浓度的纳米银液中3 h。图5是硅烷化改性2、6 h沉积银纳米颗粒之后的钛片表面扫描形貌。由图5可知,硅烷化6 h的钛片相比于2 h的钛片,沉积的AgNPs更多。

2.5 抗菌活性

生物膜的形成以及微生物在植入物表面的定植,是决定植入过程成功和持久性的主要因素。本研究采用接触杀灭策略清除附着在种植体表面的细菌,该方法是基于抗菌剂(包括AgNPs)在植入物表面的固定化,通过阻碍生物膜的形成来提供长期的抗菌活性,不需要输送抗菌药物。当AgNPs涂层的Ti暴露于细菌菌株中时,特定部分的AgNPs将被释放出来,与现有的细菌接触从而达到杀菌效果。

植入物表面的银纳米颗粒用来杀灭已经到达植入物表面的细菌,在这样的系统中可获得长期高效的抗菌性能。在图6中可以观察到滤纸盘的抑菌圈直径,发现银纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的抗菌性略高于大肠杆菌。这可能是银纳米颗粒对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的活性差异所致,归因于其表面特征,尤其是外细胞膜。而且大肠杆菌的外表面相对于金黄色葡萄球菌更柔软,导致两种细菌与接触颗粒的相互作用方式存在很大差异。

图6 空白对照组和硅烷化处理2、4、6 h载银改性后的滤纸盘组孵育24 h的抑菌圈大小Fig.6 Size of bacteriostatic zone of blank control group and the silver-modified filter paper disc group incubated for 24 h after silanization for 2, 4, and 6 h

不同硅烷化时间处理下的载银钛片对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小有细微不同。从图6中可以看出,银纳米颗粒在硅烷化钛表面的沉积改善了钛基底的抗菌特性,AgNPs的加入提高了钛样品的抑菌性能,这是由于在测试介质中样品表面释放了Ag+,抗菌活性直接取决于介质中Ag+的浓度。释放的离子可以通过破坏细菌DNA复制、耗散质子动力、增强膜透性、产生过量自由基破坏细菌功能等多种方式杀灭现有细菌。

但随着硅烷化时间的增加,样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果降低,其原因可能是延长硅烷化时间使钛片表面硅烷单层增多,与AgNPs共价连接更加牢固,抑制了更高浓度的负载银纳米颗粒的释放,从而导致抑菌效果降低。

2.6 细胞增殖情况

生物相容性材料具有与宿主组织保持和谐的能力,同时对周围细胞和组织的功能不会产生不良影响。为了评估负载AgNPs是否会对细胞造成不利影响,将样品放在含有成骨细胞的细胞培养基中培养5 d。表1列出了MTT检测结果。由表1可知,OHJ2组钛片具有最大的细胞密度。由于硅烷化处理后的钛片表面具有硅烷单层,且硅烷单层本身具有良好的生物活性,经硅烷单层包覆的载银钛片也具有一定的生物活性。样品OHJ6的细胞密度最小,一般情况下,硅烷化时间越长,细胞密度越小。这是由于Ti表面Ag+浓度较高,长时间硅烷化产生了更强的键合,这可能会导致毒性。

表1 MTT分析结果Table 1 Results of 1MTT analysis

3 结论

本文研究了预处理钛片表面蚀刻、硅烷化时间对Ag涂层钛植入物的形态特征、抗菌活性和生物相容性的影响,得到以下主要结论:

a.钛金属作为一种惰性材料植入体内,其与骨结合只是一种机械锁和,不能像生物材料那样与骨产生生物体相互作用,对机体愈合无明显促进作用;而经预处理后,钛片表面产生了三维立体网状结构,表面更粗糙,亲水性更好,更有利于与骨结合。

b.随着硅烷化时间的增加,钛片表面沉积的Si含量更高,分布更均匀,提高了对基材的附着力,形成了更均匀的硅烷单层,沉积了更多的金属颗粒。

c.硅烷化2 h的Ag涂层钛片表现出了最大的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈,同时细胞密度最大。随着硅烷化时间的增加,硅烷单层与AgNPs产生了更强的键合,使其更加稳定,抑制了更高浓度的负载纳米颗粒的释放,影响其抗菌性。同时随着硅烷化时间的增加,钛表面沉积了更多的AgNPs,影响了细胞活性,使细胞密度减小。