禽腺病毒4 型检测方法研究进展

孟 鸽，张同锋，尚佳静，张永英，罗 娟 ，封莹洁 ，于晓慧，蒋文明，刘华雷，刘冠慧，李 阳

（1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山东省郓城县行政审批服务局，山东郓城 274700）

禽腺病毒（fowl aviadenovirus，FAdV）为无囊膜的双股DNA 病毒，直径70～90 nm，呈二十面体对称结构，病毒粒子衣壳主要由六邻体（Hexon）蛋白、五邻体（Penton）蛋白和纤维（Fiber）蛋白组成。Hexon 蛋白上的7 个高度变异区是区分不同FAdV 血清型的重要区域；Fiber 蛋白上有1 个受体结合位点，其在病毒侵入宿主细胞时起重要作用[1]。FAdV 根据其基因结构与序列长短分为3 个群：Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。Ⅰ群属于禽腺病毒属，Ⅱ群属于唾液酸酶腺病毒属，Ⅲ群属于胸腺病毒属。Ⅰ群FAdV 根据限制性内切酶消化模式的不同又可分为FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E 等5 个种，也可以通过血清交叉中和试验分为1～7、8a、8b、9～11 等12 种血清型[2]。FAdV-A 对应血清型1 型，FAdV-B 对应血清型5 型，FAdV-C 对应血清型4 和10 型，FAdV-D 对应血清型2、3、9 和11 型，FAdV-E 对应血清6、7、8a 和8b 型。Kiss 等[3]对365 株FAdV 分离株的部分聚合酶基因核苷酸序列分析发现，FAdV-A、FAdV-D、FAdV-E 占比最高，分别为11%、34%、50%。Wang 等[4]研究发现，10%的FAdV 分离株与肝炎-心包积液综合征（hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS）相关。

HHS 主要由FAdV 血清4 型（FAdV-4）引起，对未接种疫苗的禽类具有较高的致死性，病死率高达80%[5]。1987 年HHS 首次被发现，此后在印度、加拿大、匈牙利、日本、韩国及波兰等国家陆续暴发[6]。自2015 年起，我国山东、湖北、江苏、安徽、江西和河北等省份均有由FAdV-4 引起的HHS 疫情的报告[7-8]。以上流行数据表明，FAdV-4 引起的HHS 呈现世界范围流行趋势，严重危害全球家禽养殖业健康、可持续发展，给家禽养殖业造成巨大经济损失，因此对FAdV-4 感染的诊断及防控显得尤为重要。本文综述了国内外FAdV-4 的血清学检测和分子生物学检测方法研究进展，以期为FAdV感染的防控提供技术参考。

1 血清学检测方法

1.1 病毒中和试验（VNT）

VNT 是指病毒与待测血清混合、孵育后，接种给易感宿主或细胞，通过观察病毒感染情况，即观察中和后病毒对宿主或细胞的感染力，对分离株进行分析鉴定的方法[9]。VNT 被认为是检测FAdV的“金标准”，具有高度的敏感性和特异性，但其操作流程复杂，主要用于血清分型和血清抗体检测[10]。Guo 等[11]利用表达EGFP-Fiber-2 融合蛋白的重组病毒FA4-EGFP，建立了一种新的检测FAdV-4 特异性中和抗体的VNT 方法。该方法仅对FAdV-4 血清有反应，并且对试验感染和临床接种家禽的FAdV-4 抗体检测均有效，与传统的VNT比较具有良好的线性相关性。该方法简化了检测程序，将检测时间由3～4 d 缩短至24 h，为监测疫苗免疫状态和诊断FAdV-4 的临床感染提供了快速、有效且节约成本的方法。栾庆东等[12]成功表达了FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11 共4 种我国主要流行血清型的可溶性Fiber 蛋白，在细胞水平进行了交叉VNT，发现4 种血清型间存在的交叉保护与病毒的Fiber 蛋白无关，这项研究结果为后续血清分型诊断方法的建立提供了理论依据。傅禹铭[13]利用VNT 发现，FAdV-4 血清能够中和FAdV-11 分离株，FAdV-8a 和FAdV-8b 不能相互交叉中和，FAdV-8b 血清能和FAdV-11 分离株产生中和，但交叉保护作用较弱，这项研究为后续疫苗研制提供了数据支持。

1.2 琼脂凝胶扩散试验（AGP）

AGP 通常是指双向双扩散试验，是最早应用于FAdV 检测的经典方法之一[14]。当可溶性抗原（蛋白质、多糖、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶（琼脂或琼脂糖）内由近及远不断自由扩散时可以形成一定的浓度梯度，在适当比例相遇时可形成肉眼可见的沉淀线，由此来检测抗体效价或抗原鉴定的一种技术，其操作简单，所用仪器少，特异性较高，结果直观容易判定[15]。张中秋等[16]和智海东等[17]利用FAdV -Ⅰ 制备琼脂扩散抗原，人工感染无特定病原体（SPF）鸡胚，可检测到沉淀抗体，表明研制的抗原可用于FAdV-Ⅰ检测。但AGP 耗时长、灵敏度低、易出现假阳性。

1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA 是基于抗原抗体特异性反应而建立的血清学方法，是将抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。该方法操作简单，特异性强，其灵敏度比常规血清学检测方法高得多，是最常用的血清学检测方法，受到广泛关注[18]。ELISA可分为间接ELISA（I-ELISA）、夹心ELISA 和竞争ELISA，根据检测目的不同，又分为检测抗原的ELISA 和检测抗体的ELISA 方法。

我国由FAdV 感染引起的HHS 临床病例有所增加[19]，因此开发一种新的快速血清学检测方法迫在眉睫。He 等[20]利用FAdV-4 JSJ13 株Fiber-2蛋白原核表达质粒作为包被抗原，建立了I-ELISA方法，并对450 份临床血清样本进行检测，结果发现未接种疫苗鸡群的抗体阳性检出率低，而接种FAdV-4 疫苗的阳性检出率超过73.3%。该方法检测FAdV-4 抗体准确、灵敏，可用于FAdV-4 野外分离株的鉴定和分子流行病学监测。Pan 等[21]用高浓度的FAdV-4 病毒粒子作为包被抗原，开发了一种用于检测12 种FAdV Ⅰ群血清型的通用ELISA方法，其能够区分FAdV Ⅰ群、FAdV Ⅲ群和其他病毒的抗体，且无交叉反应，可作为FAdV Ⅰ群血清学调查和疫苗开发的有力工具。Feichtener 等[22]开发了针对所有血清型FAdV（1～7、8a、8b、9～11）重组蛋白的ELISA 方法，并对172 份样品进行特异性检测，发现其特异性为99.3%～100%，对接种FAdV-1、FAdV-4 疫苗的家禽血清进行检测发现，其敏感性比VNT 更高。Shao 等[23]使用FAdV-4的Fiber-3 蛋白单克隆抗体4A3 和3C2，建立了一种基于单克隆抗体的夹心ELISA，此方法仅对FAdV-4 有反应，对FAdV-4 蛋白和纯化的GSTFiber2 蛋白的检测限分别为1 000 TCID50/mL 和12.5 ng/mL。

为区分FAdV-4 自然感染动物与免疫接种动物，Xie 等[24]合成了FAdV-4 22k 非结构蛋白66～88 aa 区对应的免疫原性肽，并以该肽为包被抗原，建立了FAdV-4 特异性I-ELISA 方法，其与间接免疫荧光法和商用ELISA 试剂盒检测结果的一致性分别为95%和85%，在检测临床感染样本时，其与间接免疫荧光法的一致性为80.5%，能有效区分FAdV-4 感染鸡和疫苗接种鸡，为临床样品上FAdV-4 的检测提供了一种高效的区分感染和疫苗接种的新技术。

1.4 间接免疫荧光技术（IFA）

IFA 又称荧光抗体技术，是把抗原抗体反应的敏感性和特异性同显微形态学相结合的技术，既具有高度的免疫学特性和敏感性，又具有显微形态学的精确性和直观性，可用于免疫组织化学和免疫细胞化学抗原性物质的定位研究，也可用于检测抗原或未知抗体，应用十分广泛。国纪垒等[25]通过制备FAdV-Ⅰ 12 个血清型的兔抗FAdV IgG，建立了IFA 方法，对感染鸡的各组织器官进行检测，发现该方法简单、快速、特异，是检测FAdV-Ⅰ和抗原定位的良好方法。Feichitner 等[26]开发了一种基于重组FAdV Fiber 蛋白的6 种血清型多重免疫荧光微球测定（fluorescent microsphere immunoassay，FMIA）方法，其能够在高通量技术下同时检测针对所有临床相关血清型的抗体。

2 分子生物学检测方法

2.1 聚合酶链式反应（PCR）

PCR 是一种用于扩增特定DNA 片段的分子生物学技术，其最大特点是能将微量的DNA 进行大量特异性扩增。PCR 是检测FAdV 的主要方法，具有灵敏度高、简便、快速等优点，可直接从临床或环境样品中检测FAdV，无需对样品进行处理。张梦荷[27]通过构建6 个重组质粒建立了针对FAdV I 群PCR 检测方法，其灵敏度高，可检测出3.02×10-2ng/μL 的病毒DNA。Mase 等[28]建立了一种普通PCR 方法，其可同时检测和区分FAdV的主要血清型（1、2、4、8a 和8b）。

2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）

qPCR 实现了从常规PCR 定性到定量的跨越，被广泛用于多种病原体的检测和定量，与常规PCR 相比，qPCR 具有敏感性高、特异性强，而且具有快速、高效、操作简单等优点，无需同PCR 一样进行后处理，避免了交叉污染风险。Wang 等[29]根据FAdV-4 Hexon 蛋白编码基因保守序列设计引物和探针，建立了FAdV-4TaqMan 探针qPCR 方法，其检测限为10 copies/μL，是传统PCR 的10 倍，具有高度特异性，与其他11 种血清型FAdV 以及禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽白血病病毒等均无交叉反应。卢清侠等[30]基于FAdV-4 的Hexon 蛋白编码基因保守区建立了FAdV-4 SYBR Green ⅠqPCR 方法，其最低检测限为7.1×102copies/μL，且与其他禽源病毒无交叉反应，批内和批间重复性试验变异系数均不超过2%，具有良好的特异性和重复性，可用于FAdV-4 临床早期快速检测。

2.3 环介导等温扩增（LAMP）

LAMP 是一种简单、快速、特异的核酸筛选扩增方法，无需借助复杂仪器，在恒温条件下即可实现核酸的高效扩增[31]。LAMP 检测过程中产生大量焦磷酸镁沉淀，因而可通过浊度仪测量沉淀物产生的浊度或者在紫外光源下观察反应管中的LAMP 产物[32]。唐熠等[33]根据FAdV Ⅰ群Hexon蛋白编码基因保守区序列，设计LAMP 扩增引物，建立了适用于FAdV Ⅰ群的LAMP 快速检测方法，其灵敏度可达10 copies/μL，操作简便、快速，特异性高。Yuan 等[34]建立了FAdV-4 LAMP 实时浊度法，其对FAdV-4 具有特异性，检测下限为75 copies/μL，与qPCR 结果一致。Zhai 等[35]建立了用于快速检测FAdV-4 的LAMP 与横向流动试纸条（LFD）相结合的方法，其与FAdV-7、FAdV-8b 以及鸡马立克氏病毒、传染性法氏囊病毒等均不产生交叉反应，最低检测限为 10 copies/μL，灵敏度是普通PCR 的1 000 倍，比 qPCR 高10 倍，优化后的LAMP-LFD 可在65 ℃下60 min 内完成反应，操作简单、耗时短，无需有害试剂和精密仪器，可以应用于资源有限的实验环境。Fan等[36]针对鸡细小病毒（ChPV）、鸡传染性贫血病毒（CIAV）和FAdV-4 研发了一种多重荧光环介导等温扩增（mLAMP）技术。该方法特异性良好，对ChPV、CIAV 和FAdV-4 的最低检测限分别为307、749 和648 copies/μL，可直接观察到扩增结果，可用于基层等试验设备有限的地区。

2.4 其他分子生物学检测技术

随着分子诊断技术的不断进步，等温扩增技术不断应用于核酸检测领域。重组聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA） 是一种简单、先进的DNA 扩增方法[37]。RPA 可在恒温条件下实现病毒核酸的快速扩增，通常在30 min 内完成反应[38]。研究[39-40]表明，RPA 反应利用噬菌体衍生的重组酶与单链寡核苷酸引物结合，能够在双链DNA 中寻找同源序列，保持稳定的结构，发生链置换反应形成并启动DNA 合成，对模板上的靶标进行指数式扩增。Zhang 等[41]研究出一种适用于检测FAdV 12 种血清型的RPA 方法，该方法可在14 min 内完成反应，与qPCR 相比时间缩短了74.5%，病毒DNA 核酸的阳性检出限低至0.1 fg，灵敏性极高。为降低检测所需的试剂量、时间以及检测成本，Li 等[42]建立了多重反转录实时定量PCR（MRT-qPCR）。该方法可同时检测可垂直传播或造成免疫抑制的6 种禽病毒，如马立克氏病毒（MDV）、禽网状内皮组织增殖病毒（REV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、CIAV、FAdV和传染性法氏囊病毒（IBDV），具有高特异性、敏感性和可重复性的优势。Xie 等[43]利用两种单克隆抗体（mAb），建立了针对FAdV-4 的Fiber-2蛋白编码基因的快速胶体金试纸条。该试纸条具有高特异性，对FAdV-4 及Fiber-2 蛋白的最低检测限分别为1×105TCID50/0.1 mL 及0.1 μg/0.1 mL，为资源有限地区提供了一种高效、便捷的诊断方法。

3 小结

FAdV Ⅰ群中的FAdV-4 主要引起HHS。HHS自1987 年首次在巴基斯坦安卡拉地区被发现后已在世界范围内普遍存在，给全球养禽业造成了巨大威胁和经济损失。FAdV-4 的检测方法目前主要包括血清学检测方法和分子生物学检测方法。血清学检测中，以FAdV 重组蛋白作为包被抗原建立的ELISA 方法最为常用，其灵敏度比常规血清学检测高很多。同时，ELISA 方法的简便和快速等优势，使其成为临床检测FAdV 的一种重要方法。PCR 是最常用的分子生物学诊断方法，能将微量的DNA 大量扩增；qPCR 被广泛用于多种病原体的检测和定量，与常规 PCR 相比，qPCR 具备敏感性高、特异性强，而且快速、高效、操作简单等优点；LAMP 反应时间短，设备要求简单，近年来受到了众多学者的关注；随着分子诊断技术的不断发展，已建立出可以检测12 种血清型的RPA 方法，这种可以检测不同血清型FAdV 的通用检测方法在临床上具备独特的优势。随着检测技术的快速发展，越来越多的新型检测技术逐渐被用于FAdV-4 的快速检测，为该病的快速诊断、防控提供了更有力技术支撑。