致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌RAA-LFD 快检方法的建立

田飞焱，吴 葵，黄海莉，孟 霞，裴建明，刘文珍，张锦波，李小勇，周文华，顾泽茂，徐节华

（1. 江西省农业技术推广中心，江西南昌 330046；2. 华中农业大学水产学院，湖北武汉 430070；3. 南昌市疾病预防控制中心，江西南昌 330038）

急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND）是由副溶血弧菌特定毒力 株（AHPND-causingVibrioparahaemolyticus，VpAHPND）引起的虾类疫病。该特定毒力株携带的pVA1 质粒通过编码昆虫相关光杆菌杀虫二元毒素（photorhabdus insect-related，Pir）pirA/B 而具有致病性[1-3]。AHPND 已在全球主要虾类养殖地区暴发流行并造成了严重危害，为此世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须通报水生动物疫病，2022年我国农业农村部新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为三类动物疫病。已报道的携带有pVA1 质粒并可引起AHPND 病例的弧菌种类包括副溶血弧菌、哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）、欧文氏弧菌（Vibrioowensii）和坎贝氏弧菌（Vibrio campbellii）等[2，4-7]。致病菌范围扩大无疑会增加该病的传播风险，因此快速准确检测AHPND 病原是防控的重要策略。

目前，针对AHPND 病原的特异性诊断主要是采用分子生物学方法对pVA1 质粒进行检测。WOAH 推荐的AHPND 分子生物学诊断方法包括一步法PCR[8-9]、套式PCR[10]、real-time quantitative PCR（qPCR）[11]和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification protocol，LAMP）[12]等。这些方法均需昂贵的仪器和具有较高操作技能的检测专技人员，难以满足基层实验室及生产一线的现场快速检测和普及应用。因此，有必要研究建立简易快速、仪器依赖程度低的现场检测新方法，以满足虾类健康养殖和疾病防控所需。重组酶介导扩增（recombinase-aid amplification，RAA）是一种新型恒温核酸扩增技术，其显著特点在于可实现常温下的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）解链和扩增。该方法可与侧流试纸条显色技术（lateral flow dipstick，LFD）结合，从而实现检测结果的快速、可视化判定[13]。本研究拟采用RAA 与FLD 相结合方法，针对pVA1 质粒pirB基因设计特异性引物和探针，建立特异、灵敏、可视化的RAA-LFD 快检方法，旨在为AHPND 的现场快速检测及诊断提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与临床样品

VpAHPND-65 毒力株及其他58 株副溶血弧菌，由江西省农业技术推广中心实验室分离、鉴定并保存；副溶血弧菌RIMD2210633 株、霍乱弧菌（Vibriocholera，Vc）Vc-175 株、 志贺氏菌（Shigellacastellani）CMCC 51572 株、 沙门氏菌（Salmonellaenterica）H9812 株，均由南昌市疾病预防控制中心菌种库提供；白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病病毒（infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，IHHNV）、十足目虹彩病毒（decapod iridescent virus 1，DIV1）和虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）的阳性病料组织，由江西省农业技术推广中心实验室收集、鉴定并保存。

1.2 主要试剂与仪器

RAA-nfo 核酸扩增试剂（试纸条型）盒，购自杭州众测生物科技有限公司；双标核酸检测试纸条（彩虹型），购自Tiosbio 公司；Probe qPCR Mix、细菌基因组DNA 提取试剂盒，购自TAKARA（北京）公司；DNeasy Blood & Tissue Kit，购自Qiagen 公司；含3%氯化钠的碱性蛋白胨水、TCBS 琼脂培养基、营养肉汤培养基等，购自北京路桥技术股份有限公司；HH.S11-1 型电热恒温水浴锅，购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Mastercler® ep realplex4S 荧光定量PCR 仪，购自德国Eppendorf 公司。

1.3 引物、探针设计

根据RAA-LFD 引物和探针设计原理，对GenBank 上登录的副溶血弧菌AHPND-PirB-KKVIET1株（MN480428.1）、TX-327株（MH410660.1）、HY3 株（MH718270.1）、V.03 株（KU556825.1），欧文氏弧菌SH14 株（CP045861.1）、GL605株（CP097860.1）， 坎 贝 氏 弧 菌LMB29 株（MH890610.1）、K82 株（MN846069.1），以及哈维氏弧菌K9 株（MN846071.1）、BpShHep24株（MH423892.1）等弧菌分离株PirB基因序列进行比对分析。采用Primer 5.0 软件设计引物和探针（表1），引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 VpAHPND RAA-LFD 引物和探针信息

1.4 重组质粒标准品构建

试验标准品选用的PirA/B基因序列（MH718270.1）长度为1 961 bp 的片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行核酸片段合成，并构建重组质粒pUC57-PirA/B。按公式拷贝数浓度（copies/μL）＝ 6.02×1023× 质量浓度（ng/μL）×10-9/（碱基数×660）计算，得出本试验质粒标准品的拷贝数浓度为1.17×1010copies/μL。

1.5 样品DNA 提取

用接种针挑取VpAHPND-65 株及1.1 中其他各菌株菌落，分别置于含3%氯化钠的碱性蛋白胨水、营养肉汤培养基中36 ℃摇床过夜培养，使用TAKARA 细菌基因组DNA 提取试剂盒，按说明书方法提取细菌基因组DNA，-20 ℃保存备用。WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 等DNA 样品， 则使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit 从相应阳性组织中提取获得。

1.6 反应体系建立和优化

按照众测RAA 试剂盒说明书配制扩增体系：缓冲液A 25.0 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各2.0 µL，探针（10 µmol/L）0.6 µL，模板5.0 µL，用ddH2O 补至47.5 µL。将2.5 μL 缓冲液B 添加至反应试管盖子上，在反应开始前才可混匀，此后马上将反应管移至恒温水浴锅中。首先分别在15、25、30、35、37、40 和50 ℃下扩增35 min，选取最优反应温度；再分别扩增1、5、10、15、20、25、30 和35 min，完成最优反应时间筛选。扩增结果以试纸条检测线的显色程度为判断标准。

1.7 特异性试验

分别提取VpAHPND-65 毒力株、副溶血弧菌RIMD2210633 株、霍乱弧菌Vc-175 株、志贺氏菌CMCC 51572 株、沙门氏菌H9812 株以及WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 等感染病料组织DNA 作为试验模板，应用建立并优化后的VpAHPNDRAA-LFD方法进行扩增，同时以标准品质粒pUC57-PirA/B为阳性对照，ddH2O 为阴性对照，观察是否有交叉反应，分析该方法的特异性。

1.8 敏感性试验

1.8.1 质粒检测限分析 将构建的质粒标准品pUC57-PirA/B 进行10 倍倍比稀释， 选取1.17×106～1.17×100copies/μL 的稀释液作为模板，使用建立的VpAHPNDRAA-LFD 方法进行检测，重复试验3 次，测定该方法对质粒标准品的检测限。同时以WOAH 推荐的实时荧光qPCR 法[11]作为对照，qPCR 法[11]引物、探针分别为VpPirA-F（5'-TTGGACTGTCGAACCAAACG-3'）、VpPirAR（5'-GCACCCCATTGGTATTGAATG-3'）和VpPirA-P（5'-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-TAMRA-3'）。参照Probe qPCR Mix 试剂盒说明书，配置反应体系：Probe qPCR Mix 10.0 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各0.6 µL，探针（10 µmol/L）0.2 µL，模板2.0 µL，用ddH2O补至20.0 µL。反应程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。

1.8.2 基因组灵敏度分析 将VpAHPND-65 毒力株按照1.5 中方法36 ℃过夜培养，取1 mL 菌液提取基因组DNA；同时将该过夜培养的菌液进行10 倍倍比稀释，每个稀释度各取100 μL 菌液涂布TCBS平板，36 ℃培养24 h 后，对其中菌落分布均匀且不致密的TCBS 平板进行菌落计数，得出该过夜培养的菌液菌体细胞浓度为3.8×108CFU/mL。将提取的VpAHPND-65 基因组DNA 原液进行10 倍梯度稀释，以DNA 原液及梯度稀释液作为模板，同时使用建立的VpAHPNDRAA-LFD 方法及WOAH 推荐的qPCR法[11]进行平行检测，以ddH2O为阴性对照，重复试验3 次，测定该方法所能检测到的最低菌体细胞浓度。

1.9 重复性试验

选 取3 个 拷 贝 数 浓 度（1.17×106、1.17×103、1.17×101copies/μL）的pUC57-PirA/B质粒标准品，进行组内和组间重复性试验，每个拷贝数浓度设置3 个重复。

1.10 临床样品检测

应用本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 检测方法和WOAH 推荐的qPCR 法[11]，对实验室保存的58 株副溶血弧菌基因组DNA 进行平行检测，以质粒标准品为阳性对照、ddH2O 为阴性对照，比较两种检测方法的符合率。

2 结果

2.1 反应条件优化

最佳反应温度优化结果（图1-A）显示，当反应温度低于30 ℃或大于50 ℃时，试纸条未出现试验条带，在30 ℃时出现较弱的试验条带，在35～45 ℃时各试纸条试验条带明显且无差异。因此，最佳反应温度范围为35～45 ℃。若将反应温度设置为与人体体温接近，则可利用人体体温进行扩增反应，最终选择37 ℃作为试验反应温度。

图1 反应温度和反应时间优化结果

在37 ℃条件下，不同反应时间对扩增效果的影响结果（图1-B）显示，扩增5 min，试纸条上出现极微弱的试验条带；扩增10 min，试纸条上出现微弱的试验条带；扩增15～35 min，各试纸条试验条带明显且无差异。因此，选择20 min 作为该方法的反应时间。综上，反应条件确定为37 ℃恒温水浴锅中扩增20 min，反应结束后使用侧流层析试纸条对扩增结果进行检测。

2.2 特异性试验

结果（图2）显示，只有VpAHPND-65 毒力株和阳性对照扩增产物的试纸条检测线出现了条带，其他病原及阴性对照的试纸条检测线均未出现条带。结果表明，建立的VpAHPNDRAA-LFD 检测方法具有较强的特异性。

图2 特异性试验结果

2.3 敏感性试验

2.3.1 质粒检测限分析 选取1.17×106～1.17×100copies/μL 的pUC57-PirA/B DNA 样品作为模板，分别进行RAA-LFD 和qPCR 检测。结果（图3～4）显示，两种方法的最低检出限均为1.17×101copies/μL。结果表明，建立的RAA-LFD方法具有较高的敏感性。

图3 RAA-LFD 方法的质粒灵敏度试验结果

图4 qPCR 方法的质粒灵敏度试验结果

2.3.2 基因组灵敏度分析 结果（图5～6）显示，以细菌基因组DNA 为模板，RAA-LFD 方法和qPCR 方法所能检测到的最低菌体细胞浓度均为3.8×102CFU/mL。结果表明，建立的RAA-LFD方法与qPCR 方法的检测灵敏度相当，均处于同一数量级。

图5 RAA-LFD 方法的基因组灵敏度试验结果

图6 荧光PCR 方法的基因组灵敏度试验结果

2.4 重复性试验

选取3 个稀释度（1.17×106、1.17×103和1.17×101copies/µL）的pUC57-PirA/B 质粒标准品，分别进行组内重复试验，每个稀释度设置3 个重复。结果（图7）显示，在检测线处均可观测到试验条带。组内试验结束后第7 天再进行组间重复试验，发现所有质粒标准品均得到有效扩增，控制线和检测线均有条带产生。结果表明，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 检测方法重复性和稳定性良好，具有较好的应用前景。

图7 组内重复性试验结果

2.5 临床样品检测

应用本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 快检方法和WOAH 推荐的qPCR 方法[11]对实验室保存的58 株副溶血弧菌DNA 样品进行检测。结果（表2）显示，53 株副溶血弧菌为VpAHPND阴性，5 株副溶血弧菌为VpAHPND阳性，RAA-LFD 快检方法与qPCR 结果一致。结果表明，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 快检方法和WOAH 推荐的qPCR 方法的符合率为100%，具有较高的可信度。

表2 RAA-LFD 和qPCR 方法对副溶血弧菌分离株的检测结果比较 单位：份

3 讨论

自2010 年AHPND 疫情首次被报道以来，该病一直困扰着全球虾类养殖业，目前仍无控制或减少其病原传播的有效手段。因此在疫情早期，准确和快速检测VpAHPND在疾病防控中起着关键作用。AHPND 由副溶血弧菌的特定毒力株（VpAHPND）引起。2014 年以来，研究人员针对该特定毒力株（VpAHPND）的毒性质粒（pVA1）基因先后开发了不同分子检测技术，包括一步法PCR，套式PCR，qPCR 和LAMP 等。但是这些方法费时费力且依赖专业和昂贵的仪器设备，在资源匮乏的疾病流行区域难以进行现场诊断。近些年，等温扩增技术（isothermal amplification technology，IAT）因具有不需依赖复杂的仪器，能够快速、准确地进行病原检测等优点，已作为PCR 和LAMP 等方法的替代方案得到广泛应用。Mai 等[14]建立了一种检测AHPND 病原的重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）方法，其在39 ℃恒温条件下反应30 min 后可通过凝胶电泳仪分析检测结果；陈平亚等[15]建立了一种检测AHPND病原的实时荧光RAA 检测方法，其检测结果需通过荧光检测设备进行分析，最低质粒检出限达到了8.2×101copies/μL。上述两种恒温扩增检测方法的结果分析都依赖仪器设备，这在一定程度上限制了其在基层实验室和养殖现场的应用。

LFD 是一种灵敏度高、检测时间短的现场可视化检测技术。华俊等[16]将RPA 与LFD 技术结合，建立了禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD 检测方法，该方法在37 ℃条件下反应20 min 即可通过侧流试纸条直观观测结果。本研究将RAA 与LFD 结合，建立了VpAHPNDRAA-LFD 检测方法，该方法能够在较宽的温度范围（35～45 ℃）正常工作，反应温度接近人体体温；反应耗时短，能够在20 min 内完成扩增；反应完成后，侧流层析试纸条在5 min内显色，检测结果可通过肉眼观测。上述优势进一步降低了该方法对仪器的依赖程度，适用于控温条件较差的养殖现场环境，如可利用简易的水浴锅或人体手掌心在较短时间内完成控温扩增反应，最后通过LFD 的可视化显色情况来判定结果。此外，建立的VpAHPNDRAA-LFD 检测方法灵敏度高，可检测到的最低菌体细胞浓度为3.8×102CFU/mL，最低质粒（pUC57-PirA/B）DNA 拷贝数浓度为1.17×101copies/µL，与WOAH 推荐的qPCR 方法灵敏度相当；特异性强，仅副溶血弧菌特定毒力株（VpAHPND）核酸检测为阳性；组内和组间重复试验表明该方法的重复性和稳定性良好；RAA-LFD和qPCR 方法同时对实验室分离保存的58 株副溶血弧菌的检测符合率为100%，说明VpAHPNDRAALFD 快检方法亦具有良好的可信度。

在设计引物时，本研究对NCBI 上登录的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、欧文氏弧菌和坎贝氏弧菌携带的pVA1 质粒基因进行了比较分析，发现这些基因序列相似度较高，但由于暂未获得携带pVA1 质粒的哈维氏弧菌、欧文氏弧菌和坎贝氏弧菌，因此有待后续获得上述菌株后再进行本方法的测试应用。

综上，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 检测方法能够在接近人体体温的温度范围（35～45 ℃）快速完成扩增反应，操作简单，结果肉眼可视，且具有较高的灵敏度和特异性以及良好的重复性和可信度，因此作为一种快速诊断方法具有潜在的应用前景。