失笑散化学成分分析*

王 清，魏 星，陈佩东，曹雨诞△

（1. 南京中医药大学附属医院，江苏南京 210029； 2. 南京中医药大学药学院，江苏南京 210023）

失笑散出自宋代《太平惠民和剂局方》，由蒲黄、五灵脂等量组方［1］，具有化瘀活血、散结止痛功效［2-3］，临床常用于治疗妇科痛经、月经失调和产后腹痛［4］。前期研究表明，失笑散可有效改善模型大鼠的缺氧状态，降低其全血和血浆黏度，缓解血瘀症状。其机制可能是通过血管内皮生长因子A（VEGFA）通路产生作用，调节组织型一氧化氮合酶（eNOS）水平，从而促进一氧化氮（NO）释放，并作用于环氧合酶2（COX - 2），继而调节前列腺素E2（PGE2）水平，改变血管平滑肌的紧张状态［5］。为进一步研究其效应-物质基础，现采用超高效液相色谱串联三重四极杆飞行时间质谱（UPLC - Q -TOF-MS）法分析其化学成分。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB SCIEX Triple TOFTM5600 型质谱仪（美国AB SCIEX公司）；LC-20A 型液相色谱仪，包含TF1.6 Analyst工作站及Peak View 分析软件（日本Shimadzu 公司）；Micro CL21R 型高速冰冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；FA1104 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，精度为0.1 mg）；AUW120D 型电子天平（日本Shimadzu公司，精度为0.01 mg）；KQ-500B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16C 型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；JXFSTPRP-24型球磨仪（上海净信实业发展有限公司）。

1.2 试药

失笑散（本院实验室自制）；异槲皮苷对照品（批号为111809-201403），原儿茶酸对照品（批号为110809-201205），没食子酸对照品（批号为110831 - 201605），均购自中国食品药品检定研究院，含量均大于98%；儿茶素对照品（成都普思生物科技股份有限公司，批号为PS1000-0100）；山柰酚3-O-新橙皮苷对照品（批号为X28A9L68907），香蒲新苷对照品（批号为Y14S8H43976），水仙苷对照品（批号为S08A8D33447），异鼠李素- 3 -O- 新橙皮苷对照品（批号为H30M3X1），紫云英苷对照品（批号为Y19M8H36474），对羟基苯甲酸对照品（批号为MKBK3576V），异鼠李素-3 -O- 葡萄糖苷对照品（批号为Y09J9H52567），芦丁对照品（批号为Y22S6S3719），柚皮素对照品（批号为X21M7C11378），山柰酚对照品（批号为C26J8Y38642），槲皮素对照品（批号为C09S8Y43412），异鼠李素对照品（批号为P17S9F68615），均购自上海源叶生物科技有限公司，含量均大于98%；甲醇、乙腈、甲酸均为质谱纯，其余试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。蒲黄药材饮片（南通三越中药饮片公司，批号为190504）；五灵脂药材饮片（江西赣树国家中药饮片有限公司，批号为202201）。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为Cortecs UPLC T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.6µm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min时0 B →15%B，10～15 min时15% B →30% B，15～25 min 时30% B →50% B，30～33 min 时50%B →90%B，33～34 min 时90%B →15%B）；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为2µL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正负离子模式，雾化器（GS1）气压为55 psi；气帘气（Gas）气压为40 psi；辅助加热器（GS2）气压为55 psi；喷雾电压（IS）为4 500 V；离子源温度（TEM）为550 ℃；去簇电压（DP）为-100 V；碰撞能量（CE）为- 40 V；扫描范围为质荷比（m/z）50～1500。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取1.2项下16种对照品各适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇充分溶解后定容，即得。

供试品溶液：取蒲黄与五灵脂药材饮片干燥粉末（分别过7 号筛和3 号筛）各0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，称定质量，超声（功率500 W，频率40 kHz）提取45 min，放冷至室温，再次称定质量，加甲醇补足减失的质量，吸取上清液置4 mL离心管中，4 ℃下13 000 r/ min 离心2 次，每次10 min，即得。4 ℃保存备用。

2.3 成分分析

鉴定：取2.2项下2种溶液各适量，按2.1项下试验条件进样测定，通过Peak View 及Origin 软件分析后得总离子流图，详见图1。由图1 可见，样品与单味组方药的离子流图有明显差异，表明其所含化学成分存在明显差异。结合文献［6 - 11］及对照品的数据，在正负离子模式下鉴定出化学成分53 个，包括黄酮类32 个，有机酸类17 个，氨基酸类2 个，聚酮类、酚类各1 个，详见表1。失笑散中富含黄酮类和有机酸类化学成分。由表1可见，在负离子模式下，有机酸类常出现脱羟基、羧基的碎片离子峰［12］，对羟基苯甲酸母离子为m/z138，脱去羟基、羧基后分别得到m/z121.031 1、m/z95.047 5的二级碎片。没食子酸、原儿茶酸等也出现脱去羧基的碎片离子峰。

表1 失笑散化学成分分析信息Tab.1 Analysis of chemical constituents of Shixiao Powder

图1 总离子流图A1.Negative ion chromatograms of the mixed reference solution A2.Positive ion chromatograms of the mixed reference solution B1.Negative ion chromatograms of the test solution B2.Positive ion chromatograms of the test solution C1.Negative ion chromatograms of the test solution of Typhae Pollen C2.Positive ion chromatograms of the test solution of Typhae Pollen D1.Negative ion chromatograms of the test solution of Faeces Trogopteror D2.Positive ion chromatograms of the test solution of Faeces TrogopterorFig.1 Total ion chromatograms

解析：黄酮类化学成分有较明显的分子离子峰，且常出现［M - H］-、［M - OH］-、［M - CH3］-、［M -CH3O］-及RDA 裂解的碎片离子峰［7］，如异鼠李素在负离子模式下，产生m/z315.051 3 的准分子离子峰，脱去1分子羟基，得到m/z299.030 3的碎片离子峰，脱去1 分子甲氧基，产生m/z283.028 4 的碎片离子峰，C 环发生RDA 裂解，得到m/z151.003 2 的碎片离子峰。对于黄酮苷类化学成分，则会出现脱糖基的碎片离子峰，从而有利于对苷类化合物的鉴定［9，12］，如香蒲新苷在负离子模式下可观察到脱去鼠李糖基和葡萄糖基的碎片离子峰。山柰酚-3-O-葡萄糖苷（紫云英苷）在负离子模式下的准分子离子峰为447.094 2，脱去1 分子葡萄糖基得到m/z285.033 0 的碎片离子峰，在此基础上C 环发生RDA 裂解产生m/z150.993 7 的碎片离子峰。聚酮类化合物如芦苇醇C在二级质谱图中出现脱羟基、脱羧基、支链断裂的情况，与文献［10］的报道一致。氨基酸类化学成分如苯丙氨酸在负离子模式下出现脱羧基和侧链断裂，详见图2。

图2 不同化学成分的裂解途径A.p - Hydroxybenzoic acid B.IsorhamnetinC.Typhaneoside D.Kaempferol - 3 - O - glucosideFig.2 Pyrolysis pathways of different chemical constituents

3 讨论

失笑散由蒲黄和五灵脂组方，其中蒲黄性平，味甘，能行血消瘀；五灵脂性温，味苦、咸、甘，能通利血脉、散瘀止痛，二者相须为用，为化瘀、散结、止痛的常用组合。现代药理学研究证实，蒲黄、五灵脂能抗血小板聚集，加快微循环，兴奋子宫平滑肌，加快瘀血排出。LIU等［13］的研究显示，蒲黄中所含化合物主要有黄酮类、有机酸类、酯类及多糖类，五灵脂中则主要有黄酮类及萜类成分。本研究中纳入失笑散组方药材对应成分的16 个对照品，检测到失笑散中化学成分53个，其中蒲黄中23个，五灵脂中14个，其余16个成分为两者共有。进一步分析可知，蒲黄及其与五灵脂的共有化学成分以黄酮类为主，而五灵脂独有化学成分以萜类为主，与以往的研究结果一致。该结果可为进一步研究失笑散的效应-物质基础提供科学依据。