快速样品前处理技术-超高效液相色谱串联质谱法测定粮谷中7种真菌毒素

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

4份小麦样品于2021年收获于镇江农科院行香科研基地,红豆、玉米和花生等21份粮谷样品购于本地零售超市和拼多多网上商城。

试剂及耗材:乙腈(色谱纯),美国默克公司;乙酸铵(≥98%,色谱纯),德国CNW公司;甲酸(≥99%)、氨水(≥25%)、乙酸按(≥99%),为液质专用试剂,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;质量浓度均为2.00 mg/L的标准品黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2),上海源叶生物科技有限公司;10 mg/L赭曲霉毒素A(OTA)、100 mg/L玉米赤霉烯酮(ZEN)和100 mg/L呕吐毒素(DON),美国romer国际贸易有限公司;质谱用水为屈臣氏蒸馏水;N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳(GCB),上海昕沪实验设备有限公司。

分别取7种毒素标样0.2 mL,利用体积分数84%的乙腈水溶液定容至20 mL,制成混合标准品母液。利用初始流动相将混合标准品母液稀释成适当浓度的混合标准品工作液,现配现用。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290型UPLC系统、ABsciex 4500质谱检测器,安捷伦科技(中国)有限公司;H2050R型离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;AWL-020I-P型超纯水系统,艾科浦仪器有限公司;XP105DR 型电子天平,赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 色谱和质谱条件

液相色谱柱为Agilent C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱温40 ℃,进样量1 μL,流速0.25 mL/min。梯度洗脱程序为0～1 min,90%水相(A);1～4.5 min,90%～10%A;4.5～6 min,10%A;6～6.10 min,10%～90%A;6.10～10 min,90%A。

离子源为电喷雾离子源;扫描方式为正负离子切换扫描;检测方式为质谱多反应监测(MRM),气帘气为35;电喷电压为5 500 V(或-4 500 V);温度为450 ℃;气体离子源1温度为40 ℃;气体离子源2温度为40 ℃。其他优化的质谱条件表见表1。

表1 7种真菌毒素的MRM质谱参数

1.4 色谱条件优化及样品前处理

1.4.1 色谱条件优化

将8 μg/L的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA以及250 μg/L的 DON和ZEN制成混合标准品溶液,以乙腈和水为流动相,考察甲酸、氨水和乙酸铵添加量对水相中离子化效率的影响。

1.4.2 提取溶剂的优化

准确称取粉碎的小麦样品5 g于50 mL离心管中,样品中添加混合标准品母液1 mL,加入提取溶剂乙腈(体积分数84%)的水溶液20 mL,考察提取溶剂中甲酸(0、0.5%、1%、2%、4%和8%)对7种毒素加标回收率的影响[17]。

1.4.3 净化剂的优化

小麦样品加标提取后,离心取2 mL上清液,分别按照0、10、20、35和50 mg/g小麦的量加入PSA和GCB,振荡净化30 min后,考察净化剂及其用量对7种真菌毒素加标回收的影响。

2 结果与讨论

2.1 流动相优化结果

根据7种毒素化合物的理化性质,选择乙腈为有机相,水相分别选择5 mmol/L乙酸铵、5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)和5 mmol/L乙酸铵(含0.01%氨水),正负离子切换扫描,7种毒素的离子响应强度如表2所示。

表2 7种真菌毒素的质谱离子响应强度

通过在水相中添加少量的甲酸、乙酸铵和氨水改变流动相的pH,可以改善峰形,提高质谱离子化效应[18],AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA为正离子扫描,在酸性条件下易离子化;DON和ZEN为负离子扫描,在碱性条件下易离子化。由表2可知:由于DON在流动相有甲酸的条件下无信号,而在碱性流动相条件下,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA仍有较高的响应强度。

综合考虑,采用乙腈和5 mmol/L乙酸铵(含0.01%氨水)为流动相,通过优化洗脱梯度,使色谱峰效果最佳,各毒素的色谱峰如图1所示。

图1 7种真菌毒素色谱图Fig.1 The chromatogram of seven mycotoxins

2.2 方法的线性关系、检出限和定量限

梯度稀释标准品母液2、4、8、16、32、64、128和256倍作为标准品溶液,以待测物的质量浓度(X,μg/L)为横坐标,定量离子的峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,分别以3倍和10倍信噪比(S/N)所对应的待测浓度计算检出限(LODs)和定量限(LOQs),结果如表3所示。由表3可知:7种毒素在一定的范围内呈良好的线性关系,相关系数(R2)均大于0.991,LODs为0.02～13.22 μg/L,LOQs为0.08～39.55 μg/L,符合实际检测要求。

表3 7种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.3 前处理条件优化结果

2.3.1 提取剂的优化结果

由于7种毒素化学结构和理化性质不同,提取溶剂的选择是检测过程中最重要的环节,直接影响回收率的高低。赭曲霉毒素和黄曲霉毒素多使用乙腈与水的混合液为提取剂,并加入一定的酸进行酸化[19-20],本研究在提取溶剂中加入0～8.0%甲酸,考察不同酸体积分数提取对7种真菌毒素回收率的影响,结果如表4所示。由表4可知:7种毒素在体积分数0.5%甲酸提取时有较高的加标回收率,AFB2和AFG2的加标回收率均从65%左右分别显著提高至72.32%和83.76%,而AFB2和AFG1的加标回收率低于80%,需要进一步净化。

表4 不同酸浓度提取对7种真菌毒素回收率的影响

2.3.2 净化剂优化结果

因为小麦中存在大量干扰物(如色素、蛋白和糖等),需要对提取液进行净化,GCB 对色素具有强吸附效果,PSA可除去碳水化合物、有机酸和少量色素,是目前较为常用的净化剂[12],因此本研究选取GCB和PSA作为QuEChERS净化剂。2种净化剂处理小麦加标回收率如图2所示。由图2可知:GCB对OTA、ZEN、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均有强吸附作用,对DON无吸附,适合DON的净化。当PSA用量为20～50 mg/g时,加标回收率维持在83%～105%,说明PSA适合OTA、ZEN、DON、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2 这7种毒素的净化。

图2 2种净化剂用量对7种毒素加标回收率的影响Fig.2 Effects of dosage of two sorbents on the recoveries of seven mycotoxins

因此,最终确定采用包含体积分数0.5%甲酸的84%乙腈水溶液作为提取剂,PSA作为QuEChERS 净化吸附剂。

2.4 不同粮谷样品毒素检测

2.4.1 不同粮谷加标回收率

采用优化的净化方法,对小麦、大米、玉米、花生和绿豆这5种市售粮谷样品进行分析,加标回收率如表5所示。由表5可知:7种真菌毒素的加标回收率在84.15%～103.59%范围内,均符合检测要求,该方法适合多种粮谷样品的真菌毒素检测。

表5 不同种类粮谷中7种毒素的加标回收率

2.4.2 实际样品检测

对市售的豆类、花生、面粉、大米、小麦及其成品粉状商品共计25份样品进行检测,结果如表6所示。由表6可知:DON在18份样品中均有检出,检出率达80%,均未超出限量标准;OTA、ZEN、AFB1和ABF2的检出率分别为20%、28%、24%和12%;AFG1和AFG2均未检出。OTA、ZEN和AFB1超标率分别为8%、4%和16%,超标样品均为粉状制品,说明粮谷深加工产品的毒素超标风险较大,为确保粮食制品质量安全,在加工环节中对真菌毒素污染物监测具有重要意义。

表6 市售粮谷样品7种毒素检测结果

3 结论

建立了基于QuEChERS-UPLC-MS/MS检测技术的粮谷样品7种真菌毒素的快速检测方法。在优化色谱流动相后,7种毒素拥有较好的峰形和较高的响应强度;通过优化提取溶剂和净化方法,有效提高了方法的加标回收率。该方法中7种毒素在各质量浓度范围内线性关系良好(R2>0.99),检出限低,灵敏度高,适用于豆类、花生、玉米、大米和小麦5种样品的真菌毒素检测。利用本方法对25份粮谷样品进行检测,OTA、ZEN、DON和AFB1检出率较高。因此,需要加强对这4种真菌毒素的检测和防护,保障国家食品安全。