特异性乳糖酶的开发研究进展

侯 超,张申平,马跃龙

(1. 上海市质量监督检验技术研究院,上海 200233;2. 国家食品质量监督检验中心(上海),上海 200233)

乳糖酶,又称β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23),由于具有水解乳糖、生成葡萄糖和半乳糖的特点,因此可用来降低含乳糖制品中乳糖含量,提高含乳糖产品的可消化性,解决乳糖不耐受问题[1]。此外,乳糖酶还具有半乳糖苷转移作用,可用来生产低聚半乳糖(GOS)[2]。

虽然乳糖酶的来源[3]非常丰富,包括植物、动物和微生物,但乳糖酶的实际应用企业数量少,只有广东江门量子高科生物工程有限公司利用乳糖酶来生产低聚半乳糖,澳优集团也成功推出苏芙拉乳糖酶调制乳粉。因为实际应用的复杂条件限制了乳糖酶的应用,如,在冷链条件下无法高效水解牛乳中乳糖,乳糖酶容易受到胃液的影响而散失活性,工业生产的复杂反应条件导致乳糖酶的重复使用次数少、回收率低。因此,寻找适合特定应用条件下的特异性乳糖酶就显得尤为重要。本文对特异性乳糖酶及其酶学特性进行介绍,对定向进化和应用策略方面进行总结,为特异性乳糖酶的开发和应用提供思路,以期促进乳糖酶在乳品工业中的应用。

1 特异性乳糖酶分类及研究

特异性乳糖酶没有严格的定义,它是基于乳糖酶的应用背景,即在特定应用环境中能保持高酶活和稳定性的乳糖酶,可称为特异性乳糖酶。这需要乳糖酶具有耐高温(>50 ℃)、低温(<10 ℃),酶活高,耐酸性、耐盐,酶活受溶剂影响小等特性。

1.1 耐热乳糖酶的研究

一般把酶活最适温度在50 ℃以上的乳糖酶称作耐热乳糖酶。由于耐热乳糖酶在高温反应条件下具有独特的工业生产和应用优势,包括增加底物溶解度、提高反应速率、减小水解产物对酶活的抑制作用、降低微生物的污染风险等,所以,相对于常温乳糖酶,耐热乳糖酶具有更强的应用性[4]。

嗜热细菌是产耐热乳糖酶的重要来源,嗜热细菌一般生长温度在55 ℃以上,以其为来源开发的乳糖酶具有较好的耐热稳定性。Kong等[5]从嗜热细菌中克隆了一个新的β-半乳糖苷酶基因,并在大肠杆菌细胞中表达以产生β-半乳糖苷酶,结果发现:重组酶在75～90 ℃表现出相当高的热稳定性,重组酶在75、80、85和90 ℃下的半衰期分别为10.5、4.0、1.0和0.3 h。李云等[6]从芽孢杆菌中筛选到一株高产β-半乳糖苷酶的菌株,并对纯化酶进行酶学性质研究,结果发现:β-半乳糖苷酶的最适水解反应温度是60 ℃,而且70 ℃放置60 min后,酶活仍然保留65%,可见,该β-半乳糖苷酶具有较高的热稳定性。乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶的稳定性差限制了它在低聚半乳糖合成和其他需要高温操作中的应用,Rico-Díaz等[7]为了获得耐热变体,通过在酶亚基之间引入二硫键的合理诱变策略获得高活性菌株,与相同条件下的天然酶相比,耐热稳定性增强且半衰期也有所增加[7]。

1.2 低温乳糖酶的研究

为实现乳品的冷链加工和运输,尽可能保留乳品的风味和营养成分,低乳糖牛乳的工业化生产首选低温乳糖酶水解牛乳乳糖。理想的适合低乳糖牛乳加工的低温乳糖酶应该在低于10 ℃以下时,仍具有较高的酶活,且催化活性不受水解产物半乳糖、葡萄糖以及牛乳中Na+和Ca2+影响。筛选适合在牛乳体系中高效水解乳糖的低温乳糖酶,是低乳糖牛乳生产企业关注的焦点,因此,在低温下具有高活性的乳糖酶具有商业、经济和环境效益[8]。

大多数低温乳糖酶来自嗜冷菌和节杆菌,因为嗜冷菌长期生长在低温环境下,最适生长温度低。如,关波等[9]利用嗜冷杆菌制备低温乳糖酶,生产的乳糖酶在低温下具有较高的酶活。拉杰等[10]制备了能够在低温下生产无乳糖或低乳糖产品的乳糖酶,这些乳糖酶不但具有相对高的酶活,而且在反应时对温度和pH的耐受性较好。张宇洁等[11]从天山中国一号冰川沉积物中分离出产低温β-半乳糖苷酶的菌株,对其酶学特性研究后发现:在4 ℃时,该酶酶活为最大酶活的78%;10 mmol/L的Na+对酶活抑制作用不明显,Ca2+对酶活具有激活作用。李梦等[12]建立了一种符合微生物宏基因组文库构建要求的DNA提取方法,为低温乳糖酶基因筛选奠定了基础。姚从禹[13]从海洋微生物中克隆β-半乳糖苷酶,在大肠杆菌中进行外源表达,针对该酶在低温下酶活好但不稳定的特性,利用复合酶保护剂提高其稳定性,使它能高效水解牛奶中的乳糖。

1.3 耐盐乳糖酶的研究

乳清是生产干酪的副产物,直接排放会造成严重的环境污染。若利用乳糖酶水解乳清可合成低聚半乳糖,但乳清中含有的无机盐会对乳糖酶的酶活造成一定的抑制作用,所以乳糖酶耐盐能力影响其应用前景。张文洪等[14]发现,滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶具有很好的NaCl稳定性,经4 mol/L的NaCl溶液处理1 h后,相对酶活保留率仍很高。Wang等[15]等通过筛选土壤宏基因组文库,获得一种新的β-半乳糖苷酶基因,并将其在毕赤酵母中表达,结果发现,该酶在0 ℃不仅有好的活性,而且低浓度盐溶液(10 mmol/L NaCl溶液)能提升酶活。Karan等[16]对南极洲深湖中的盐藻卤虫来源的β-半乳糖苷酶基因进行克隆表达,并表征酶学性质,结果发现,该酶具有嗜冷和嗜盐特性,且在4 mol/L NaCl溶液或20%(体积分数)有机溶剂中都有很好的稳定性。

1.4 酸性乳糖酶的研究

在酸性条件下发挥最大酶活性的乳糖酶叫酸性乳糖酶,可用于生产乳糖酶制剂,能缓解机体乳糖不耐受[17]。酸性乳糖酶通过水解奶粉中的乳糖,可促进牛奶有效成分的吸收和利用[18]。如,黑曲霉和米曲霉来源的乳糖酶酶活最适pH分别在3.0～4.0、4.5～5.1,适合干酪和酸性乳清的水解[19]。

1.5 耐溶剂化乳糖酶的研究

乳清粉是乳清干燥浓缩后产物,可利用乳糖酶将乳清粉中的乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,而且酿酒酵母能以此为底物发酵制备乙醇[20],但乳糖酶的酶活在反应中会受到乙醇溶剂的影响,继而影响最终的生产效率。Karan等[21]发现,极端嗜盐古菌Halorubrumlacusprofundi来源的乳糖酶在体积分数10%的乙醇溶液中稳定且具有活性,高盐浓度(4.5 mol/L NaCl)溶液对其活性没有影响。Wang等[22]从新疆盐碱地的菌中克隆并表达一个乳糖酶编码基因galM,结果发现,该酶在多种有机溶剂中仍能保持活性,并且对葡萄糖和半乳糖也具有良好的耐受性,可以此来生产生物乙醇。

2 特异性乳糖酶催化机制

特异性乳糖酶的催化机制主要有保持型机制和反转型机制。目前普遍认为特异性乳糖酶的催化机制是保持型水解机制[23]。特异性乳糖酶催化乳糖反应可简单分为2个过程(图1),分别是糖基化和去糖基化过程。亲核氨基酸攻击半乳糖苷键中心形成半乳糖基和酶的复合中间体,羧基基团作为酸碱催化剂将质子传递到糖苷键的氧原子上,同时释放一分子葡萄糖,此为糖基化过程。复合中间体和水反应生成半乳糖(水解反应),复合中间体和糖分子或乳糖反应时生成低聚半乳糖(转糖苷反应),水解反应和转糖苷反应均为去糖化过程[24]。

图1 特异性乳糖酶催化反应机制[24]Fig.1 Characteristic lactase catalytic reaction mechanism[24]

3 特异性乳糖酶高产菌株选育

乳糖酶在乳制品中的应用范围广,但传统工业生产的乳糖酶产量低、生产成本高,因此不利于其广泛应用。为了获得高产菌株,研究者们进行了大量的研究,已经取得一定的进展[25-27]。特异性乳糖酶和乳糖酶的高产菌株选育技术类似,主要集中在传统理化诱变育种技术和基因工程技术。传统理化诱变育种技术包括物理诱变技术、化学诱变技术和复合诱变技术。基因工程技术是将优良的乳糖酶基因导入生长迅速且容易培养的微生物中,得到相应的基因工程菌,进一步通过对发酵条件优化来提高乳糖酶生产量,从而降低生产成本。特异性乳糖酶异源表达系统主要有大肠杆菌表达系统、乳酸菌表达系统、酵母表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统。

3.1 传统理化诱变育种技术

3.1.1 物理诱变技术

物理诱变是通过辐照处理使染色体缺失、重组或断裂等,从而引起后代性状产生变异[25],目前常用的诱变源有射线、超声波和离子束等。紫外线照射是最简单的物理操作技术,条件容易获取且操作简单,常用于微生物的诱变处理。刘芳宁等[26]通过紫外照射对米曲霉进行诱变实验,获得了最佳照射时间为15 min,继而诱变筛选得到一株产乳糖酶能力增加幅度最大的突变株,酶活比初始菌株提高了49.22%。杜海英等[27]采用60Co-γ线诱变出发菌株的原生质体,对黑曲霉进行诱变,获得高产高温乳糖酶的突变菌株,最终突变菌株产特异性乳糖酶酶活是原始菌株的2.73倍。

相比较于传统辐射源的突变频率低、随机性大等缺点,常压室温等离子体技术(ARTP)应运而生,它具有诱变操作温度低、突变快、多样性高、与细胞作用明显以及对环境要求低等优点[28]。邱雯雯等[29]以ARTP诱变方式对乳酸克鲁维酵母进行不同时长的诱变处理,得到4株高产乳糖酶的突变菌株,其酶活均大于原始菌株,其中最大乳糖酶酶活是原始菌株的2.8倍。

3.1.2 化学诱变技术

化学诱变是利用化学诱变剂使DNA烷基化损伤或碱基错配、置换从而引起突变的诱变技术。化学诱变剂种类很多,主要有亚硝基胍[30]、甲基磺酸乙酯[31]、硫酸二乙酯等[32]和2-脱氧葡萄糖[33]。Ibrahim等[34]使用化学诱变剂对2株双歧杆菌进行诱变后发现,诱变菌株的产酶量比野生型增加2倍多。刘文玉等[35]通过亚硝基胍对野生低温β-半乳糖苷酶产生菌株进行诱变,筛选出产酶活比原始菌株提高54%的菌株。

与物理诱变相比,化学诱变一般是基因的点突变,对基因组的损伤小,突变点具有特异性,但是所用试剂一般具有毒性,使用时应注意安全。

3.1.3 复合诱变技术

复合诱变技术一般同时采用2种及2种以上诱变技术进行诱变,通过复合诱变可以解决单一诱变技术的局限性,增加基因突变类型。复合诱变技术通常是物理诱变技术相互复合、物理诱变技术和化学诱变技术复合、化学技术相互复合。李宁等[36]采用紫外线和60Co-γ线协同诱变,选育出产高温乳糖酶的高产黑曲霉菌株,突变株产酶能力和酶活均比出发菌株有所提高。刘文龙等[30]以米曲霉菌株作为出发菌株,采用紫外线和亚硝基胍复合诱变的手段,获得一株遗传稳定性良好的高产乳糖酶菌株,其产乳糖酶酶活较初始菌株提高62.1%。高兆建等[37]通过微波辐照和亚硝基胍复合诱变,获得高产突变菌株,产酶量比原始菌株的提高了115.92%。

3.2 基因工程技术

3.2.1 大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统因具有良好的表达稳定、遗传机制研究清晰、生产周期短及易于放大培养等优点,在重组蛋白的表达方面有着广泛应用[38]。李宗显等[39]利用大肠杆菌表达系统成功将克雷伯氏菌来源的乳糖酶基因诱导表达后,所产酶活比野生菌株的提升近10倍。Liu等[40]从凝结芽孢杆菌NL01中克隆了一种新的热稳定乳糖酶,在大肠杆菌中表达,该酶显示出优于商业酶的乳糖水解能力。Li等[41]从海洋细菌Alteromonassp.中克隆了一个新的β-半乳糖苷酶基因(gal2A),在大肠杆菌中表达,该酶表现出高转糖基活性,可用于生产低聚半乳糖。

3.2.2 乳酸菌表达系统

乳酸菌是一种安全级的益生菌,乳酸菌表达系统作为一种原核表达系统[42],本身可产杀菌物质,无内毒素产生,在安全性方面有着明显的优势。Schwab等[43]将多种不同来源的乳糖酶基因转入表达载体,并在乳酸乳球菌(Lactococcuslacti)中成功表达,但该系统也存在以下不足:乳酸菌在工业生产的复杂环境中难以存活,外源基因在乳酸菌中表达后,一些分泌蛋白无法分泌而滞留在细胞壁上,影响目标产品的提取效率。目前,乳酸菌表达系统还没有在工业上进行大规模应用。

3.2.3 酵母表达系统

酵母表达系统的纯化步骤简单,具有良好的生物活性,重组产物不含内毒素[44]。对于在原核表达系统中无活性蛋白和错误折叠的蛋白,可以尝试用酵母表达系统进行表达。Becerra等[45]成功实现乳糖酶在酿酒酵母中的表达。王敏[46]将米曲霉来源的乳糖酶在乳酸克鲁维酵母表达系统中表达并进行条件优化,最终酶活达142.57 U/mL。

毕赤酵母是酵母表达系统中最常用的表达宿主,利用甲醇作为碳源和能量来源。与酿酒酵母相比,毕赤酵母系统具有强大的分泌表达能力,表达的蛋白产量大、活性高、细胞外杂蛋白少且纯化成本降低[47],适合用于商业化生产乳糖酶。侯重文等[48]将米曲霉来源的乳糖酶基因克隆到毕赤酵母表达系统中成功表达,最终水解乳糖的酶活达530 U/mL。考虑到甲醇为碳源可能会导致残留毒性和火灾等安全风险,胡梦凯等[49]等构建了非甲醇诱导表达载体来改善毕赤酵母中乳糖酶的表达。

3.2.4 枯草芽孢杆菌表达系统

枯草芽孢杆菌表达系统虽具有不易混入内毒素[50]、蛋白直接分泌到胞外、有利于后续的纯化和生产成本低等优点,但其存在转化效率低、自身分泌的蛋白容易将目的蛋白降解等不足。田康明等[51]通过基因工程技术获得了乳糖酶编码基因及其重组酶,在枯草芽孢杆菌中表达,获得了具有较好低聚半乳糖生产能力的乳糖酶。

综上可知,诱变育种操作简单,需要通过大量的诱变试验,利用高通量筛选方法从中筛选出高产菌株,但诱变育种致死率较高,一般应用于实验室研究中。基因工程技术能有效提高乳糖酶产量,从根本上解决乳糖酶产量问题,适用于商业化生产,但基因工程技术潜在的危害也不容忽视,需要通过进一步研究对其进行安全性论证。

4 乳糖酶定向进化研究进展

自然界野生型乳糖酶很难满足现有应用需求,通过定向进化可获取相关应用需求的基因。许多理性和非理性的工程策略已成功应用于优化乳糖酶,包括定点突变、截短突变、位点饱和突变、随机突变、DNA改组和酶蛋白的单体修饰[52]。乳糖酶在DNA或蛋白质水平上的变化能获得满足其应用环境的特性,如,减少产物抑制作用、提高热稳定性、改变产物成键类型、提高乳糖酶转糖苷能力,这极大地促进了乳糖酶的应用和发展。

4.1 减少产物抑制作用

在乳糖酶催化乳糖水解反应时,半乳糖需要在反应过程中离开酶活性位点以进行持续催化。然而,半乳糖会因为与结合位点的相互作用而滞留在酶的活性位点上,从而导致产物抑制作用[53],难以实现高浓度乳糖的完全水解。因此,寻找耐半乳糖的乳糖酶一直是大家关注的热点。Liu等[54]通过改变产物与酶相互作用相关残基的定点突变来减轻产物抑制作用,结果发现,随着半乳糖和突变酶之间的亲和力降低,突变酶在乳糖水解中具有潜在应用价值。Zhao等[55]利用定点突变策略来生产富含低聚半乳糖的酸奶。Zhang等[56]通过蛋白质修饰来改善乳糖酶特性,降低半乳糖抑制作用。

4.2 提高热稳定性

酶反应还需要更高的操作稳定性,尤其是在较高温度下的工业应用中。Ishikawa等[57]对乳糖酶进行定点诱变,获得了在60 ℃下具有更好热稳定性的三重突变体(K166P、G307P、A833P)[57]。Rico-Diaz等[7]通过在亚基界面引入半胱氨酸对乳酸杆菌来源的乳糖酶进行合理突变,突变体 (R116C、T270C、G818C) 在45 ℃的半衰期提高了6.8倍,且催化活性提高;同时发现,热稳定性和活性的提高可能与亚基之间形成二硫键有关,有助于强化蛋白结构。

4.3 改变产物成键类型

乳糖酶的分子进化也会影响产物的特异性,包括糖苷键和聚合状态。Yin等[58]发现,环状芽孢杆菌来源的天然乳糖酶倾向于催化β-1,4键,通过饱和突变产生的突变体R484S和R484H能合成包含交替的β-1,3和β-1,4键的新低聚半乳糖结构,增加了产物成分中β-1,3键的比例。

4.4 提高乳糖酶转糖苷能力

在乳糖酶催化低聚半乳糖反应中,产物可继续成为水解的底物,最终造成低聚半乳糖的产率较低。 对催化残基外进行定点诱变可以改善转半乳糖基化的性质,但酶的水解活性不会完全消除。 Hassan等[59]对乳糖酶进行合理设计,获得了与-1和+1亚位点相关的3个突变体(Y296F、F417S和F417Y),使低聚半乳糖产量由39.3%提高到50%以上[59]。同样,Wu等[60]通过定点诱变来自S.solfataricusP2的乳糖酶获得的2个突变体(F359Q 和 F441Y),以此生产低聚半乳糖的产率为58.3%和61.7%,而天然酶产率为50.9%[60]。

5 特异性乳糖酶应用策略

乳糖酶作为一种食品添加剂,在乳品工业中应用广泛,可用于低聚半乳糖的生产[61]、无乳糖/低乳糖牛奶的生产[62]、乳制品副产物乳清的降解[63-64]和低乳糖冰激凌的生产[65]等。超滤膜对大分子低聚糖和生物酶有优异阻隔作用,能有效用于游离特异性乳糖酶生产低聚半乳糖中所得的小分子低聚糖分离过程[66]。

虽然游离特异性乳糖酶的催化效果较好,但存在稳定性差、不能重复使用等缺点,导致生产目标的成本增加。为了保证特异性乳糖酶的催化特性,可以采用固定化酶技术。固定化特异性乳糖酶是将特异性乳糖酶与载体相互作用,将特异性乳糖酶限制在一定的空间内。特异性乳糖酶可通过物理和化学方法进行固定。物理方法包括吸附法和包埋法,化学方法包括共价结合法和交联法。一般采用吸附法将特异性乳糖酶固定在载体材料上,这样可以最大限度保留特异性乳糖酶的“特性”,但酶与载体作用力不强,容易脱落。交联法是利用酶自身的双功能团结构在交联剂作用下连接起来的一种固定方法,是酶与载体结合最有效和最稳定的方法之一,可使酶和载体间键合;也可在无载体情况下,使酶分子间形成聚合物。该法操作成本低,能防止酶泄露,但交联反应可能发生在酶的活性中心,从而使酶活降低或失活,降低固定化酶的回收率[67]。

为了提高特异性乳糖酶的固定化使用效率,有时将2种或2种以上的固定化方法联用,如,吸附-交联、包埋-交联、吸附-包埋-交联等。吸附法可以提高乳糖酶的固定化率,包埋-交联相结合的方法能够增加结合强度,可解决乳糖酶泄露和固定化乳糖酶操作稳定性问题。

6 结论与展望

特异性乳糖酶在乳品工业中的应用是一个持续性研发热点,特异性乳糖酶的研究一直集中于从天然来源中筛选、基于应用条件采用分子手段对其特性进行调控和固定化应用等方面。本文以特异性乳糖酶的应用为出发点,对特异性乳糖酶进行介绍,从特异性乳糖酶的催化应用、酶的生产、酶的定向进化和应用策略等方面进行综述。

特异性乳糖酶的分子调控技术(定点突变)极大地提高了转糖基化活性和底物耐受性,扩大了其应用范围。通过研究酶的三维结构和功能的关系,开发高效的高通量筛选方法来检测转糖基化活性,可以加速商业化特异性乳糖酶的生产。随着基因工程技术的发展,特异性乳糖酶的催化机制和调控机制会有更深入的研究,新的特异性乳糖酶基因也会不断地被克隆和突变,应逐渐提高其在食品工业方面的安全性研究。在实际应用中,固定化特异性乳糖酶能很好地发挥其特性,但在固定化过程中会损失一部分特性,应开发新的固定化方法和应用载体来保持或增加其催化特性。