溶剂梯度双柱循环色谱在微量杂质分离制备中的应用

郝思怡，朱群英

（陕西省药品和疫苗检查中心, 陕西 西安 710075）

0 引 言

杂质是除了药物中的活性成分以外的化学成分，其对药物的疗效与稳定性具有不良影响，同时还会产生毒副作用，从而影响药物的临床安全性。由于杂质的鉴定阈值比较低，传统的分离方法如溶剂萃取等只能用于溶液的预分离，目前比较常用的杂质分离技术为色谱分离法[1-2]。常见的色谱分离技术包括柱色谱、循环色谱、薄层色谱等方法。其中薄层色谱法(Thin Layer Chromatography,TLC)是将固定相均匀涂抹在玻璃板上(或其他支物上，如塑料片或铝制薄板)成膜，然后用适当的点样器将样品点加在薄层的起始线上，待溶剂挥发后，置入展开槽中，用一定的溶剂展开，当展开到适当距离时取出，晾干，显色后定性、定量。

柱色谱包括高压、中压以及常压制备柱色谱，制备柱色谱是目前应用最为广泛的分离技术，其结构简单，且具有很强的灵活性。但该方法要求各组分间必须存在较大的分离度，否则会导致产率不高等情况发生。此外该方法还存在非线性的吸附现象从而导致产品被过度稀释[3]。模拟移动床（Simulated Moving Bed，SMB）技术主要通过改变样品进出的方式实现固液两相“模拟”逆流，实际上是实施色谱分离的高度工程化过程。相比于柱色谱技术，SMB 的处理规模大、分离效率高，但其工艺较为复杂且成本较高[4]。因此，综合考虑制备工艺、设备成本以及分离效率，研究在双柱循环色谱的基础上引入了溶剂梯度，并将其应用于微量杂质的提取制备中，期望此方式能为杂质分离提取提供新思路。

1 溶剂梯度双柱循环色谱的杂质分离与制备

1.1 溶剂梯度双柱循环色谱的杂质分离

常见的色谱分离技术中的TLC 具有能同时分离多种样品、固定相和流动相的选择与变换灵活性大、可利用多种定性检测技术(如物理和化学方法等)特点。但该方法操作量大且精度较低，因此应用较少。单柱循环色谱主要是通过阀门切换技术使谱带在单色谱柱内进行循环往复流动，其能够在不外加压力的条件下延长等效柱长。但其易产生展宽现象，从而导致分离失败，故研究对其进行改进并应用于杂质分离中，改进后的单柱型阀切换循环色谱改变了原溶质谱带的经过路径，其不再流入贮存池而是直接流入溶剂泵。该技术减小了柱外死体积，在一定程度上提升了分离效率。此外，零死体积循环色谱技术通过使用二位4 通阀形成了闭合回路，并在循环回路外设置了溶剂泵，该方法能够有效避免由柱外死体积所造成的谱带展宽现象，但目前该技术尚未应用到色谱的制备中[5-6]。交替泵双柱循环色谱主要通过二位6 通阀来进行色谱柱的位置切换，且每个色谱柱的出口处都安装了检测器以对溶液谱带的洗脱情况进行监测，其结构如图1。

图1 交替泵双柱循环色谱Fig. 1 The alternating pump dual column cyclic chromatography

由图1 所示，当检测器1 监测信号值上升，且检测器2 监测到信号值降低时，二位6 通阀将进行阀门的切换使谱带流入色谱柱2 中。该色谱能够在不使用泵的情况下使谱带在两个色谱柱间循环流动，且能够避免由泵腔死体积引起的谱带扩展情况发生，但其存在容纳谱带宽度不够长的问题[7]。因此，研究基于此引入了捕集系统，并在循环系统中设置了捕集柱，由此形成了带捕集系统的双柱型循环制备液相色谱。该系统主要将纯水注入捕集柱中以增加流动相的含水率，从而使溶液富集在捕集柱中，具体的装置结构如图2 所示。

图2 带捕集柱的双柱型循环色谱Fig. 2 The dual column cyclic chromatography with capture column

带捕集柱的双柱型循环色谱处理起到富集作用，还可以在六通阀与十通阀之间进行耦合切换。但该系统要求流动相的含水率不能过高，否则可能会导致固定相的塌陷以及流失，从而造成捕集能力下降。此外，通过改进双柱型循环结构基本能够避免柱外死体积的情况发生，但在实际的杂质提取过程中，仍然存在涡流扩散、传质阻力以及谱带展宽等不良现象。其中，谱带展宽主要是由非线性吸附和一些非理想因素造成的，其为杂质的分离过程带来了严重的负面影响。谱带展宽会对合格的流份进行稀释从而导致其浓度降低，且容易引起分解变质。而谱带压缩机制能够使谱带前沿的迁移速度低于谱带后沿，形成溶剂梯度，进而起到对谱带的压缩作用[8-9]。因此，研究进一步引入了溶剂梯度，并将其应用到双柱循环色谱之中。该技术主要通过在双柱之间不断注入一种弱溶剂，从而在上下游的流动相间形成了洗脱强度差，使得处于上游柱中的谱带后沿速度加快。这种方式很大程度地提升了循环色谱的分离性能，且有利于产品浓度的增加以及产量的提高，提高产率并增大产品浓度，与传统的双柱型色谱相比具有显著优势。因此研究将该技术运用到微量杂质的分离制备中，以解决杂质分离效率过低等问题。

1.2 基于溶剂梯度的双柱循环色谱实验

研究将引入了溶剂梯度的双柱循环色谱应用到实际的关键前杂分离中，并设计了相应实验进行测试。实验选用的材料为奥利司他原料、乙腈、甲醇以及纯净水。实验采用反相色谱对奥利司他进行分离制备，并选取甲醇与水的混合溶液作为流动相、C8 柱作为固定相。同时，实验选用的装置为溶剂梯度双柱循环色谱装置，该装置的组成部分包括2 根色谱柱、1 个二位10 通阀、1 个检测器和3 个高压恒流泵，其具体装置如图3 所示。

图3 溶剂梯度循环色谱装置Fig. 3 The solvent gradient cyclic chromatography device

目标杂质的体积主要由洗脱剂中的水含量决定，通过增大循环色谱的下游水含量可以使谱带收缩。但由于增加洗脱剂中的水含量可能会导致溶剂消耗增大、分离时间过长等问题，因此实验将甲醇与水的比例设为了87/13 至89/11 之间。要实现目标杂质的分离与纯化，必须保证杂质谱带处于循环色谱系统的整个循环周期内，其中，谱带的前沿不能流出下游色谱柱，而后沿必须从上游色谱柱被洗脱出来，具体表示如式（1）所示。

式（1）中，F1代表上游的洗脱剂流量，F2指的是下游流量，VR，up、VR，down分别表示上下游流动相组成下的关键杂质的保留体积，△t 代表循环周期。其中，上游流量不能过高，否则会对检测器造成破坏，因此其流量设为3 mL/min，下游流量过大也会对谱带的压缩作用造成抵消，因此实验将其设为了3.08 mL/min，同时，修饰剂流量设为了0.08mL/min。奥利司他的关键前杂分离实验一共分为了三个阶段，分别是进料阶段、循环阶段以及回收阶段。其中进料阶段是指在色谱装置处于位置A 状态时将原料全部注入到色谱柱1 中。在循环阶段中，先添加洗脱液，再在设备中添加弱溶剂，使其成为改性剂。这时，前杂波段将由1 号柱子移入2 号柱子，阀将转换到B 位。在此过程中，奥利司他的波段向下游移动，并向外排出，此时，目的波段由第2 色谱柱向第1 色谱柱传递，形成一个循环。在此基础上，通过多个开关，可以将非靶标杂质排出体系，并将靶标杂质与整个能谱的前线分离。回收阶段中，一般是在前杂与目标组分分离到一定程度时，对目标谱带的前沿和后沿进行切割处理，并收集中间纯度最高的部分作为最终产品。

溶剂梯度循环色谱分离技术需要对溶剂梯度、循环周期、洗脱剂含水率以及循环次数进行研究。实验选取关键杂质的纯度、产率以及收率几个指标来对分离效果进行评价。收率计算表示如式（2）所示。

式（2）中，VProduct、VFeed分别代表产品以及原料的体积，AProduct、AFeed分别表示关键杂质在产品与原料中的峰面积。产率的计算如式（3）所示。

式（3）中，CFeed代表关键杂质在原料中的浓度，T表示运行时间，其中包括了进料、循环以及回收阶段所消耗的时间。为了直观看出浓度谱带的收缩程度，还需要计算相对浓度，其计算如式（4）所示。

2 溶剂梯度循环色谱在杂质分离中的应用分析

研究为验证溶剂梯度循环色谱分离技术的有效性，分别采用不同的洗脱剂含水率、溶剂梯度、循环周期，以及循环次数进行实验对比，实验条件及结果如表1 所示。

表1 溶剂梯度循环色谱分离技术的实验条件及结果Table 1 The experimental conditions and results of solvent gradient cyclic chromatography separation technology

由表1 可得，洗脱剂含水率分别为11%、12%、13%，原料进料体积分别为52.9mL、62.4mL、73.3mL，循环周期时长分别为18.5min、21.5min、24.5min，溶剂梯度均为1.0%。不同洗脱剂含水量情况下的纯度、收率与产率结果如图4 所示。由图4可知，洗脱剂含水率越高，产品的纯度、收率以及产率均随之提升。相比于11%的洗脱剂含水率，13%的洗脱剂含水率的纯度、收率及产率分别提升了15.2%、7%、5.2%。说明洗脱剂含水量的增加有利于关键杂质与奥利司他的分离。同时可以看出，产率与收率随水含量增加的趋势逐渐变缓，说明循环周期对其影响逐步增加，倘若继续增加含水量可能造成产率与收率降低且会增加溶剂消耗，因此研究选用的洗脱剂含水率为13%。此外，从三次实验的关键杂质相对浓度的数据来看，可以说明溶剂梯度能够实现对关键杂质的分离以及富集。

图4 不同洗脱剂含水量的纯度、收率与产率Fig. 4 The purity, yield, and productivity of different eluents with different water contents

实验3~实验5 主要考察了溶剂梯度对分离过程的影响，其中，实验设置的洗脱剂均为13%，原料体积为73.3mL，循环次数均为8 次，循环周期均为24.5min，溶剂梯度依次为1.0%、2.0%、1.5%。同时需要保证在修饰剂流量不变的条件下改变修饰剂的含水量以调整溶剂梯度大小。由表1 可知，目标组分的相对浓度溶剂随着溶度梯度的增大而增加，说明谱带受到的压缩力随着梯度的增加而有所提升。溶剂梯度对产品纯度、收率以及产率的影响效果如图5 所示。由图5 可知，产品的纯度在溶剂梯度为1.5%时达到最高，其值为52.3%。因此研究选用的溶剂梯度为1.5%。

图5 不同溶剂梯度的纯度、收率与产率Fig. 5 The purity, yield, and productivity of different solvent gradients

实验5~实验7 主要考察了循环周期对分离效果的影响，其中，实验设置的洗脱剂含水量均为13%，溶剂梯度均为1.5%，循环次数均设为了8 次，循环周期分别设为了24.5min、26.5min、28.5min。循环周期时长对产品纯度、收率以及产率的影响效果如图6 所示。由图6 可知，产品的纯度以及收率随着循环周期的加长而增大，其中循环周期为28.5min 的产品纯度为72.5%，相比于24.5min 的循环周期增长了20.4%。同时，循环周期为28.5min 的产品收率高达90.1%，说明随着循环周期时长的增加，奥利司他与关键杂质的分离效果也随之提升。但产率波动不大，主要原因在于其受到循环周期与收率的限制。此外，循环周期不宜过长，否则会导致目标组分流出下游的色谱柱，因此研究选用28.5min 作为循环周期。

图6 不同循环周期下的纯度、收率与产率Fig. 6 The purity, yield, and productivity under different cycle cycles

实验7~实验9 主要考察循环次数对分离过程的影响，其中，实验设置的洗脱剂含水量均为13%，溶剂梯度均为1.5%，循环周期时长为28.5min，循环次数依次为8 次、10 次以及12 次。图7 为循环次数对的纯度、收率以及产率的影响结果。

图7 不同循环次数下的纯度、收率与产率Fig. 7 The purity, yield, and productivity under different cycles

通过图7 可得，当循环次数为8~10 次时，随着循环次数的增加，杂质的纯度和收率均随着循环次数的增加而提升，但循环次数从10 次到12 次的增长较为平缓。主要原因在于奥利司他以及关键前杂的总宽度会随着循环系数的增加而增大，而谱带压缩机制会抑制总谱带的展宽。因此当循环次数继续增加到12 次时，谱带的压缩与总谱带的展宽会趋于动态平衡，因此，研究选择10 次作为最终的循环次数。

3 结 论

药物微量杂质的分离提取对药物的安全性具有重要影响作用。研究将溶剂梯度与双柱循环色谱技术相结合，设计出了一种药物杂质分离新方法。结果表明，在探究循环周期对分离效果的影响实验中，产品的纯度以及收率随着循环周期的加长而增大，其中循环周期为28.5min 的产品纯度为72.5%，相比于24.5min 的循环周期增长了20.4%。在探究洗脱剂含水率对分离效果的影响实验中，产品的纯度、收率以及产率随洗脱剂含水率的提升而增加。在考察洗脱剂含水率对分离过程的影响实验中，关键杂质的纯度和收率随着循环次数的增加而提升。说明溶剂梯度双柱循环色谱技术能够有效解决杂质分离效率过低、分离纯度不高等问题。但研究对于溶剂梯度在双柱循环色谱技术中的应用只考虑到反相层面，因此有待进一步改进。