NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

张新要，侯子航，郑淑心，刘向阳，闫筱筱，蒲文宣，崔 红*

1.湖南中烟工业有限责任公司技术中心，湖南省长沙市劳动中路386 号 410007

2.河南农业大学烟草学院，郑州市郑东新区平安大道218 号 450046

烟草叶面腺毛是叶片表皮细胞的特化结构，能够特异地合成和分泌二萜化合物、蔗糖酯等多种生物活性物质和香气前体物质，对烟株抗性和烟叶品质具有积极影响［1-3］。烟碱是烟草特有的次生代谢物质，影响烟叶的劲头、吃味和香气品质，是评价烟叶和卷烟品质的重要指标之一［4］。因此，提高烟草腺毛密度和烟碱含量是烟草品种改良的重要目标，但关于二者的聚合定向改良还未见报道。

茉莉酸（Jasmonate acid，JA）信号分子调控是提高烟碱含量的重要途径之一［5］。JAZ（Jasmonate zim domain，JAZ）蛋白是JA 信号途径的负调控因子，在SCFCOI1复合物作用下被26S蛋白酶体降解，释放茉莉酸信号途径的正向调控因子，促进茉莉酸早期应答基因的转录［6］。在烟草中，NtJAZ1 与NtMYC2a、NtMYC2b 以复合物形式存在；在茉莉酸信号诱导下，NtJAZ1 被降解，NtMYC2a、NtMYC2b得以释放，并与NtPMT1a启动子G-Box 区域结合调控其转录，从而促进烟碱生物合成［7-8］。郑淑心等［9］利用基因编辑技术，创制了K326 的NtJAZ1基因纯合突变株系NK-9，其烟碱生物合成关键基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表达水平显著提高，烤后烟叶烟碱含量提高40%以上，但叶面腺毛密度和腺毛分泌物含量有明显降低。鉴于腺毛及其分泌物对烟株抗性和烟叶品质的重要性，在利用NtJAZ1作为靶点进行烟碱含量改良时，如何保证叶片具有较高的腺毛密度至关重要。烟草腺毛发生受NtCycB2负向调控，敲除该基因之后烟草叶面腺毛密度显著提高且对烟株发育无明显影响［10-11］。为了在提高叶片烟碱含量的同时维持较高的腺毛密度和腺毛分泌物含量，以NtCycB2纯合突变株系hairy K326为材料，利用CRISPR/Cas9 技术对NtJAZ1进行敲除，筛选纯合突变株系并进行农艺性状、腺毛密度、生物碱含量、烤后烟叶化学成分的比较分析，拟阐明NtCycB2、NtJAZ1共敲除对烟株生长发育、腺毛发生、腺毛分泌物和烟碱积累的影响，为进行烟碱和叶面化学成分的聚合改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为烟草K326 和hairy K326，hairy K326为课题组前期创制的NtCycB2基因突变的多腺毛K326突变株系［10］。hairy K326的种子经消毒后接种于MS培养基上，在恒温（28±1）℃、恒湿60%±2%、16 h 光/8 h 暗的条件下进行培养，无菌苗用于遗传转化。

1.2 试验方法

1.2.1NtJAZ1基因敲除载体构建及遗传转化

根据茄科基因组网站（https://solgenomics.net/）已发表的烟草NtJAZ1基因两个拷贝的序列（Nitab4.5_0000073g0270.1、Nitab4.5_0004234g0080.1），利用CRISPR2 在 线 软 件（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）设计靶序列：5′-CCTCAAGAAGTTATT TCTACTGC-3′，合成二聚体后构建NtJAZ1基因敲除载体（pCBSG012-JAZ1），见图1。

图1 NtJAZ1基因敲除载体结构Fig.1 Structure of NtJAZ1 knockout vector

采用叶盘法［12］对hairy K326 进行烟草遗传转化。叶圆片经侵染和共培养，置于分化培养基（MS+Cef 0.500 00 g/L +Hyg 0.006 00 g/L + 6-BA 0.001 00 g/L + NAA 0.000 15 g/L）上进行分化筛选，不定芽转入生根培养基（MS+Hyg 0.008 00 g/L+NAA 0.000 10 g/L）进行培养，获得潮霉素抗性植株。

1.2.2 分子鉴定

提取潮霉素抗性苗DNA，利用引物1（F1:5′-CTAGGAAAGGCTAAAAAGAAACAGT-3′；R1：5′-GGATTGTGATATTGGCTGAGTT-3′）和引物2（F2:5′-CGAAATTCTTGAGTCAAATTGG-3′；R2：5′-AAC ATTTTAGAAGTTGGAGGAG-3′），分别对NtJAZ1-1、NtJAZ1-2进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送华大基因进行序列测定。突变单株自交收获种子，并进行纯合鉴定。

1.2.3 烟草农艺性状调查

试验材料于2021年3月移栽种植于湖南浏阳隔离封闭试验田，田间种植和管理按照烤烟栽培技术流程［13］和当地优质烟叶栽培规程进行。按标准方法在烟草初花期分别测量株高、叶片数、叶长、叶宽、茎围、节距等农艺性状指标［14］。

1.2.4 烟草生物碱的提取和测定

分别在烟草现蕾期、打顶后1 周和成熟期取K326、hairy K326和J-21株系中部叶片，测定生物碱含量（质量分数）。将杀青后的鲜烟叶烘干碾磨，过0.25 mm 孔径的样品筛。取200 mg 烟末，在碱性条件下用甲基叔丁基醚（MTBE）提取生物碱，以正十六烷为内标，参照行业标准方法［15］通过气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）定量检测生物碱含量，3次重复。

1.2.5 腺毛形态观察及密度统计

在烟草现蕾期选取上部叶片（长度约10 cm）进行腺毛观察。使用0.2%（质量体积分数）罗丹明B溶液染色20～30 min，用无菌水清洗后采用超景深显微镜（VHX-5000，日本基恩士公司）进行腺毛形态观察和密度统计。

1.2.6 烟草叶面化学成分分析

在烟草中部叶片成熟期，选取5 株生长发育一致、健壮无病害的烟株，取第12叶位的叶片，参照李旖梅等［16］的方法进行叶面化学成分的萃取和检测，3次重复。

1.2.7 常规化学成分测定

选取烤后B2F 等级烟叶，采用连续流动化学分析仪（AA3，德国SEAL），按照行业标准［17-19］测定水溶性总糖、还原糖、烟碱、氯、钾含量（质量分数），3次重复。

1.2.8 中性香气物质测定

选取B2F 等级烤后烟叶，参照赵铭钦等［20］的方法测定烟叶中性香气成分含量。

1.2.9 数据分析

使用SPSS 17 统计分析软件对数据进行单因素（One-way ANOVA）方差分析及差异显著性检验（LSD 法，P<0.05 或P<0.01），使用SigmaPlot 14.0 数据分析绘图软件制图。

2 结果与分析

2.1 NtJAZ1基因敲除和纯合突变株系鉴定

以hairy K326 为材料，进行NtJAZ1基因编辑载体的遗传转化。经过潮霉素筛选后，共获得了38 株阳性植株。利用特异引物对突变位点进行测序，有10 株在gRNA 区域检测到序列突变，基因编辑效率为26.32%。其中，J-21中的NtJAZ1-1和NtJAZ1-2均发生突变，NtJAZ1-1在250～253 bp 处4 个碱基发生了替换，NtJAZ1-2序列在254～255 bp处缺失了A和G 2 个碱基（图2A）。NtJAZ1-1和NtJAZ1-2所发生的序列突变均导致翻译提前终止和功能缺失（图2B）。

图2 NtJAZ1基因敲除株系的分子鉴定Fig.2 Molecular identification of NtJAZ1 knockout lines

2.2 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除对烟株生长发育的影响

K326、hairy K326 和J-21 漂浮育苗，于2021年3月移栽种植于湖南浏阳封闭试验田中。在整个生育期中，J-21 生长发育正常，大田长势与K326 和hairy K326无明显区别（图3）。烟株农艺性状调查结果显示，与K326 和hairy K326 相比，J-21 株系在株高、叶数、叶长和叶宽等方面虽有所变化，但均无显著差异；与K326 相比，J-21 和hairy K326 的节距明显减小，茎围有所增加，见表1。

表1 烟株农艺性状统计分析①Tab.1 Statistical analysis of agronomic characteristics of tobacco plants

图3 田间烟株形态观察Fig.3 Morphological observation of tobacco plants in the field

2.3 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除对腺毛密度和分泌物积累的影响

在现蕾期分别对K326、hairy K326 和J-21 的上部叶片进行腺毛观察和密度统计，结果如图4（A，B）所示。从图4 中可以看出，J-21 株系腺毛发育完善，腺头饱满，罗丹明染色后呈现深紫红色。腺毛密度统计结果依次为hairy K326＞J-21＞K326，J-21株系的腺毛密度比K326 提高113.18%，但比hairy K326有所降低。这说明NtCycB2基因敲除能够显著提高腺毛密度，NtJAZ1基因敲除对腺毛密度有负面影响，而NtCycB2和NtJAZ1基因共敲除能提高腺毛密度并促进腺头发育。

图4 腺毛形态观察和叶面化学成分分析Fig.4 Morphological observation of trichome and analysis of leaf surface chemical components

利用GC/MS 技术对K326、hairy K326 和J-21 成熟的中部叶片进行叶面化学成分的萃取和分析，结果如图4（C、D）所示。从图4 中可以看出，K326、hairy K326和J-21的叶面化学成分组成一致，含量高低依次为J-21＞hairy K326＞K326，J-21的叶面化学成分总含量比K326和hairy K326分别提高156.35%和41.65%。其中，西柏烷二萜含量分别比K326 和hairy K326提高192.49%和34.46%，蔗糖酯含量分别比K326 和hairy K326 提高113.50%和65.90%，烷烃含量无明显变化。表明NtCycB2基因和NtJAZ1基因共敲除对叶面化学成分积累有积极影响。

2.4 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除对叶片烟碱积累的影响

分别对现蕾期、打顶后1周和成熟期的中部叶片进行生物碱含量测定，结果如图5所示。从图5中可以看出，K326、hairy K326 和J-21 的生物碱均由烟碱、新烟草碱、降烟碱和假木贼碱组成。其中，烟碱含量占生物碱总量的90%以上。随着叶片的生长发育，烟碱含量呈现上升趋势。与K326 和hairy K326相比，J-21 的烟碱含量均极显著提高。现蕾期烟碱含量差距最为明显，J-21 分别比K326 和hairy K326提高213.33%和261.54%；打顶后J-21烟碱含量提高幅度减少，分别比K326和hairy K326提高29.73%和27.43%；在成熟采收期，J-21 的烟碱含量比K326 和hairy K326 分别提高37.14%和32.28%。说明NtCycB2和NtJAZ1基因共敲除在提高腺毛密度和分泌物含量的同时，对生物碱合成也具有明显的促进作用，而且主要发生在打顶前。

2.5 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除对烤后烟叶化学成分的影响

2.5.1 常规化学成分分析

对不同材料的B2F等级烟叶进行常规化学成分测定，结果如表2所示。从表2 中可以看出，与对照相比，J-21 的烟碱、总氮和钾含量显著提高。其中，J-21 的烟碱含量分别比K326 和hairy K326 提高39.81%和45.32%，J-21 的总氮含量分别比K326 和hairy K326 提高18.97%和13.74%，J-21 的钾含量分别比K326 和hairy K326 提高43.70%和21.25%。总糖含量相比于K326 有所下降，比hairy K326 则有所提升，还原糖含量相比于K326 和hairy K326 均有所下降，氯含量无显著变化。总体来看，各化学成分含量均处在适宜范围内。

表2 烤后烟叶常规化学成分分析Tab.2 Results of routine chemical components in cured tobacco leaves

2.5.2 中性香气成分分析

采用GC/MS 技术对B2F 等级烟叶进行中性香气物质分析，结果如表3所示。从表3 中发现，J-21的中性致香物质总量增加，分别比K326 和hairy K326 提高13.79%和5.44%。其中，西柏烷类降解产物茄酮的含量增幅较高，比K326 增加217.49%，比hairy K326 增加48.45%，这与叶面化学成分检测结果的变化趋势相一致。另外，J-21 的类胡萝卜素降解产物、新植二烯含量也有明显增加。

表3 中性致香物质成分分析Tab.3 Results of neutral aroma components in cured tobacco leaves

3 讨论

腺毛密度和烟碱含量与烟株抗性和烟叶品质密切相关，二者都是烟草品种改良的重要目标。NtJAZ1 通过与NtMYC2 结合抑制烟碱生物合成关键基因的转录和表达，是进行高烟碱烟草定向改良的理想靶点之一［7］。但在K326 的NtJAZ1基因敲除纯合株系中，叶面腺毛密度明显降低［9］。这说明NtJAZ1基因功能缺失在促进烟碱合成的同时，对腺毛发生具有一定的抑制作用，并对烟株抗性和烟叶品质产生不利的影响。烟草腺毛发育与烟碱合成同样受到茉莉酸信号的诱导，这在本氏烟中已有报道，Yan X等［21］发现NbJAZ3基因在MeJA诱导本氏烟长柄腺毛发生过程中起关键作用。

为弥补NtJAZ1敲除对腺毛发生的不利影响，在提高烟碱含量的同时维持较高的腺毛密度，本研究中以NtCycB2基因敲除的多腺毛K326 突变品系hairy K326 为材料，进行NtJAZ1基因编辑，获得了NtCycB2、NtJAZ1同时突变的纯合株系J-21，其烟碱含量比对照提高了39.81%，这与在K326 中单敲NtJAZ1基因的结果相一致，而且两个材料都表现出打顶前烟碱含量增幅较大，打顶后增幅降低的趋势［9］。其原因可能是在正常情况下，打顶刺激了茉莉酸的大量合成，导致NtJAZ1被降解，促进烟碱合成加速；而在NtJAZ1功能缺失之后，烟株对打顶刺激的敏感性降低，因而导致了烟碱合成增幅明显下降。与单敲NtJAZ1基因相比，NtCycB2、NtJAZ1双敲株系J-21腺毛密度和分泌物含量比K326显著提高；与NtCycB2基因敲除的hairy K326相比，J-21腺毛密度虽有所降低，但分泌物含量却明显提高。由此推测，NtJAZ1对腺毛的物质代谢具有一定的促进作用，腺毛形态观察和罗丹明组织化学染色结果进一步验证了这一推论。

NtCycB2、NtJAZ1双敲对烟株生长发育无不良影响，而且表现出较强的田间综合抗性，这可能与其多腺毛、高烟碱的特性有关。已有的研究证明，NtCycB2敲除导致的多腺毛烟草具有较高的耐旱［22］、耐盐［23］、抗虫［24］、耐镉［25］能力。当然，NtCycB2、NtJAZ1双敲导致烟碱含量和腺毛分泌物含量的显著提高，这对烟叶感官品质及工业可用性的影响还有待于进一步深入研究。

4 结论

通过CRISPR/Cas9 技术创制了NtCycB2和NtJAZ1共敲除的K326 突变株系J-21。研究发现，NtCycB2和NtJAZ1共敲除在不影响烟株正常的生长发育的前提下，与K326 相比，叶面腺毛密度和腺毛分泌物含量分别提高113.18%和156.35%，烤后烟叶西柏烷类降解产物茄酮含量提高217.49%，烟碱含量提高39.81%，这表明NtCycB2和NtJAZ1在烟碱含量和腺毛密度的聚合定向改良中具有较大的应用潜力。