茉莉酸甲酯对烟草分泌型和非分泌型腺毛形态发生的影响

娄亚楠，王召军，杨欣玲，张洪映，牛德新，杨永锋，崔红

1 河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002；2 河南中烟工业有限责任公司，郑州市陇海东路72号 450000

腺毛是植物表皮细胞的特化结构，在植物防御反应及次生产物生产中具有重要作用[1]。腺毛形态功能多样，一般分为非分泌型腺毛（non-glandular trichome, NGT）和分泌型腺毛（glandular trichome,GT）两大类：NGT由单细胞或多细胞组成，营养缺乏，质地坚硬，构成了植物的物理防线[2]；GT结构复杂，具有合成和分泌多种化合物的能力，既是植物的化学防线，也是生产高附加值次生产物的“生物化工厂”[3-4]。烟草（Nicotiana tabacum）的腺毛有3种类型：（1）长柄分泌型腺毛由3～5个细胞的腺柄和1～12个细胞的腺头组成，是烟草主要香气前体物质西柏烷和赖百当化合物合成和分泌的主要场所[5-6]；（2）短柄分泌型腺毛由单细胞的腺柄和4-细胞的腺头组成，是烟草叶面抗性蛋白（T-phylloplain）的合成场所[7]；（3）非分泌型腺毛为不具备分泌能力的多细胞矛状结构。由此可见，腺毛的密度和类型与烟株抗性和烟叶品质密切相关，因此阐明烟草腺毛的发生机制对烟草品种改良具有重要意义。

茉莉酸（Jasmonic Acid, JA）及其衍生物茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonic Acid, MeJA）作为重要的植物激素，广泛参与植物生长发育调控以及植物对环境胁迫的应答反应[8-10]。已有研究表明，JA对拟南芥（Arabidopsis thaliana）单细胞非分泌型腺毛发生具有调控作用，喷施JA能显著提高拟南芥的非分泌型腺毛密度[11]，阻断拟南芥内源JA的生物合成也可显著降低其非分泌型腺毛密度[12]。与拟南芥不同，烟草等茄科植物腺毛多为混合型，由多种分泌型与非分泌型腺毛组成，JA对其腺毛发生的影响作用则更为复杂。番茄(Solanum lycopersicum)有7种类型的腺毛，包括4种分泌型（I, IV, VI, VII）和3种非分泌型（II,III, V）[13]，JA对番茄分泌型腺毛的发生，尤其是VI型腺毛，具有明显的诱导作用[14-16]。栽培烟草“中烟100”在MeJA处理之后，长柄分泌型腺毛密度也有明显增加[17]。表明JA对茄科植物分泌型腺毛发生具有一定促进作用，但对非分泌型腺毛发生的影响还很少有报道。这主要是因为在混合型植物中，分泌型腺毛比非分泌腺毛更加引人关注；另外，也与混合型植物的腺毛种类繁多、相互作用复杂、难于观察有关。

对于腺毛为混合型的植物来说，腺毛突变体材料的发现和利用是研究腺毛发生机制的捷径。普通烟草Tobacco Introduction 1112（T.I.1112）为非分泌型突变型；Tobacco Introduction 1068（T.I.1068）为高分泌型突变型，二者常用于烟草叶面化学、抗性及香气改良的研究[18-20]。本研究分别以T.I.1112和T.I.1068为材料，在无菌条件下喷施不同浓度的MeJA并进行腺毛形态的比较观察，旨在解析其对烟草分泌型和非分泌型腺毛形态发生的影响，为阐明烟草腺毛发生的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

普通烟草T.I.1068和 T.I.1112裸种，来源于牛津烟草种质库（Oxford Tobacco Research Station, in Oxford, North Carolina, USA）。种子经10%次氯酸钠消毒后接种在MS培养基上，在人工气候室内进行培养，温度控制在28/22℃（昼/夜）， 相对湿度 75 ± 5%，光周期 14/10 h（昼/夜），光合有效辐射（PAR）为400 µmol /m-2.s-1。

1.2 MeJA处理

用无水乙醇助溶MeJA配制1.5 M的标准母液，再用蒸馏水分别稀释至1 mM、3 mM和5 mM，然后过滤灭菌（0.22 μm的滤膜）至离心管中，备用。

选择长势一致的六叶期无菌苗，分别喷施2 mL不同浓度的MeJA溶液，使叶片充分湿润。对照组用无菌水处理。每7 d喷施一次，共喷施3次。

1.3 腺毛形态观察

待种子萌发至子叶期、四叶期和六叶期时，分别取子叶、第一片真叶和茎（上胚轴），利用超景深显微镜（基恩士VHR-5000，日本）进行表面观察；在MeJA处理21 d后，每个浓度处理随机选取3株，取新生叶进行组织化学染色、腺毛形态观察和密度统计。

腺毛组织化学染色法参考Lin和Wagner的方法[21]，并稍加改动。取小于5 cm的新生幼叶，在0.2%（w/v）罗丹明B 水溶液中浸染30 min，后用蒸馏水漂洗3次，冲洗掉未结合的染料。吸干表面水分，利用超景深显微镜对叶片表面进行观察，并在上表皮中部随机选择3个视野进行腺毛密度统计分析。

1.4 数据处理和统计方法

试验数据采用SPSS 22软件进行分析，用新复极差法分析均值差异的显著性，显著性水平P＜ 0.05，以a、b、c、d表示其差异性，不同字母表示差异有统计学意义；采用Excel 2007软件绘图制表。

2 结果

2.1 T.I.1068和T.I.1112腺毛形态观察

在种子萌发和幼苗生长过程中，分别对T.I.1068和T.I.1112的子叶、第一片真叶和茎（上胚轴）表面腺毛进行形态观察，结果如图1所示。可以看出，在种子萌发过程中，无论是T.I.1068还是T.I.1112，子叶上都无腺毛的发生(图1-1,7），随着真叶的形成各种类型腺毛也开始出现，并随着叶片的伸展而不断地发生、发育（图1-2,3,8,9）。T.I.1068叶片上的腺毛具有1至多个腺头细胞，皆为分泌型。其中，一种含有多个柄细胞，为长柄分泌型（A），另一种仅有单个柄细胞，为短柄分泌型（B）（图1-2,3）。T.I.1112叶片上也有2种腺毛，一种具多个柄细胞，无腺头细胞，为非分泌型腺毛（C），一种为短柄分泌型腺毛（B）（图1-8,9）。T.I.1068茎上的腺毛为单一的长柄分泌型，随着烟株发育腺头逐渐增大、腺柄伸长，腺毛密度增加（图1-4,5,6）。在T.I.1112茎上的腺毛最初类似于单腺头的分泌型腺毛（图1-10,11），但发育至6叶期时，则表现为典型的非分泌型保护毛形态（图1-12）。单腺头的分泌型腺毛可能是非分泌腺毛发育过程中出现的过度形态，这也说明对茎部腺毛类型的观察应该在6叶期之后进行。

图1 T.I.1068和T.I.1112腺毛形态观察Fig.1 Trichome observation of T.I.1068 and T.I.1112

2.2 MeJA对T.I.1068腺毛发生的影响

在6叶期选取生长一致的T.I.1068幼苗，分别喷施浓度为1 mM、3 mM、5 mM的MeJA溶液，3周后对新生叶片和茎进行糖酯染色和腺毛形态观察。可以看出，随着MeJA浓度的逐渐升高，烟株生长并没有明显变化，但5 mM MeJA处理的烟苗有叶片发黄和早衰现象（图2）。显微观察发现，T.I.1068叶面、茎上的腺毛皆为分泌型，腺头部分可被罗丹明染成红色，表明其含有较多的糖酯类化合物（图3-1，5）。随着MeJA浓度的升高，叶边缘腺毛数量逐渐增多，腺头的体积逐渐增大，着色也逐渐加深（图3-2,3,4）。茎表面的腺毛随MeJA浓度变化的趋势与叶面腺毛一致。在5 mM MeJA处理下，茎表腺毛的密度、长度、腺头大小及着色程度都达到了最高值（图3-6,7,8）。另外，在所有的MeJA处理中，T.I.1068腺毛的类型都未发生改变，依然是由长柄和短柄的分泌型腺毛组成，并无非分泌型腺毛的产生。对叶上表皮腺毛密度统计也表明，随着MeJA处理浓度的升高，长柄分泌型腺毛的密度逐渐增加，短柄腺毛密度变化不大且有随MeJA浓度逐渐降低的趋势，而非分泌型腺毛则完全缺失（图4）。

图2 MeJA处理对T.I.1068烟株生长的影响Fig.2 Influence of exogenous methyl jasmonate treatment on T.I.1068 growth

2.3 MeJA对T.I.1112腺毛发生的影响

选取生长一致的6叶期T.I.1112幼苗，分别喷施不同浓度的MeJA，3周后取新生叶片和茎进行糖酯染色和腺毛形态观察。随着MeJA浓度增加，T.I.1112幼苗的生长受到明显抑制，5 mM MeJA处理的烟苗叶片明显发黄、早衰（图5）。显微观察发现，T.I.1112的腺毛大部分是非分泌型腺毛，不能被罗丹明染色表明其糖酯类化合物合成能力较弱（图6-1,5）。从叶边缘来看，MeJA处理后，腺毛数量虽无明显变化，但腺毛类型发生了改变，新出现了能够被罗丹明染色的长柄分泌型腺毛。而且，随着MeJA浓度的升高，长柄分泌型腺毛的数量增加、着色程度加深（图6-2,3,4）。在茎上，长柄分泌型腺毛同样被MeJA所诱导，且随MeJA浓度的升高而增多。在5 mM MeJA处理下，茎表面长柄分泌型腺毛的数量多、腺头体积大且着色深（图6-6,7,8）。对叶片上表皮腺毛密度的统计也表明，MeJA处理成功地诱导了长柄分泌型腺毛的发生，其密度随MeJA浓度的提高而增加；与之相反，短柄分泌型腺毛密度稍有降低，而非分泌型腺毛的密度在MeJA处理前后无明显变化（图7）。

图3 不同浓度外源MeJA处理对T.I.1068腺毛发生的影响Fig.3 Effect of different concentrations of exogenous methyl jasmonate on glandular trichome morphogenesis on T.I.1068

图4 MeJA处理对T.I.1068叶面腺毛密度的影响Fig.4 Effects of methyl jasmonate treatment on leaf trichome density of T.I.1068

图5 MeJA处理对T.I.1112烟株生长的影响Fig.5 Influence of exogenous methyl jasmonate treatment on T.I.1112 growth

图6 不同浓度外源 MeJA处理对T.I.1112腺毛发生的影响Fig.6 Effect of different concentrations of exogenous methyl jasmonate on glandular trichome morphogenesis on T.I.1112

图7 MeJA处理对T.I.1112叶片腺毛密度的影响Fig.7 Effects of methyl jasmonate treatment on leaf trichome density of T.I.1112

3 讨论和结论

腺毛作为植物防御体系的重要组成部分，在阻碍病虫害侵袭、耐受干旱、寒冷、紫外线等逆境胁迫中发挥着积极作用。烟草腺毛形态多样、功能各异，对烟株抗性和烟叶品质具有较大影响[7，22-24]。因而，对烟草不同类型腺毛发生机制和影响因素的研究具有重要意义。

在非分泌型腺毛植物拟南芥中，关于JA对腺毛发生的促进作用已积累了充分的证据，其分子调控机制也逐步得以阐明[25]。纯粹的分泌型腺毛植物在自然界中很稀少，大部分植物为混合型。混合型植物中分泌型腺毛与非分泌型腺毛共存，相互之间不可避免地存在复杂的竞争与抑制作用，使得研究难度加大。而各种腺毛突变体的应用，无疑有助于阐明混合型植物不同类型腺毛对JA的应答反应。分泌型番茄突变体hl经MeJA处理后，分泌型腺毛密度提高了85.7%，无非分泌型腺毛发生；非分泌型突变体wolly中，非分泌型腺毛密度提高了37.8%，分泌型腺毛无明显变化；而在各自的野生型中，仅分泌型腺毛受到MeJA的诱导，非分泌型腺毛密度无明显变化[26]。本研究对普通烟草分泌型突变体T.I.1068和非分泌型突变体T.I.1112进行MeJA处理，发现T.I.1068中长柄分泌型腺毛增加，短柄分泌型腺毛无明显变化，无非分泌腺毛的发生；在T.I.1112中，非分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛数量并无明显变化，而原本不存在的长柄分泌型腺毛在MeJA的诱导下大量发生。这表明MeJA对烟草分泌型腺毛发生具有诱导作用，而对非分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛的发生并无显著影响，这与栽培烟草“中烟100”的研究结果相一致[17]。由此看来，烟草、番茄等多细胞非分泌型腺毛与拟南芥的单细胞非分泌型腺毛不同，二者对JA信号的不同反应表明其调控机制存在一定差异；而烟草的长柄分泌型腺毛发生所表现出的对JA信号的敏感性，表明其与拟南芥非分泌型腺毛发生机制相似。最近，在青蒿研究中发现了HD-ZIP IV家族转录因子AaHD1，该基因受到JA信号的诱导并与Jasmonate ZIM-domain 8 (AaJAZ8)蛋白互作，正向调控分泌型腺毛的发生，证明分泌型腺毛与拟南芥非分泌型腺毛具有类似的调控机制[27]。但AaHD1对青蒿分泌型腺毛和非分泌型腺毛发生都具有促进作用，这与烟草和番茄又不相同。这充分说明了植物腺毛发生机制的复杂性，因此对多细胞非分泌型腺毛发生调控机制还需进一步研究。

JA对腺毛发生的影响具有一定的浓度效应。在本研究中，无论T.I.1068还是T.I.1112，腺毛的形态变化随着MeJA处理浓度的提高而更加明显。在5 mM MeJA处理中，T.I.1068腺毛密度、腺头体积及着色深度都达最大值，T.I.1112中所产生的长柄分泌型腺毛数量最多、着色也最为明显。Rowe等[28]也报道，低浓度MeJA（0.1 mM）对向日葵分泌型腺毛发生无影响，高浓度MeJA（1 mM）可引起分泌型腺毛密度增加，但不排除MeJA抑制叶片发育所产生的影响。前人研究发现，JA会影响植物的生长发育，如引起叶片早衰[9]。本研究也发现用5 mM MeJA处理时，叶片表现出发黄、早衰的现象。为此，实验中取小于5 cm的新生叶片进行观察，基本可以忽略因叶片发育程度不同而产生的对腺毛密度的影响。

T.I.1068和T.I.1112是重要的普通烟草腺毛突变体类型，但其突变产生的原因还不清楚。本研究发现MeJA可以诱导T.I.1112长柄分泌型腺毛的发生，暗示该非分泌突变体的形成可能与JA生物合成途径受阻有关，这些结果为解析烟草中最为重要的腺毛类型——长柄分泌型腺毛的发生调控机制奠定了基础。烟草腺毛发生分子机制的解析，将有利于创制不同类型、不同密度的烟草腺毛育种模块，可望通过对烟草叶面化学成分和含量的定向调控来实现对烟草品质和抗性的改良。

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