不同圆周卷烟主流烟气挥发物组释放量的差异

张 华，廖惠云，钱建财，杨 松，张 媛，秦艳华，朱怀远*，聂 聪*

1.江苏中烟工业有限责任公司，南京市建邺区兴隆大街29号 210019

2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

随着卷烟市场消费需求的多元化，细支和中支卷烟逐渐成为烟草企业和消费者关注的热点［1-2］。已有研究［3］表明，相同烟丝在细支、中支和常规粗支卷烟下的感官特征存在显著差异，这是由于细支、中支和常规粗支卷烟烟气成分的生成、过滤及扩散发生了根本性变化。因此，从多角度分析不同烟叶原料在不同圆周卷烟下烟气成分释放的差异，阐明不同圆周对卷烟挥发性组分释放的影响规律，有助于提升卷烟产品设计。目前，国内外针对不同圆周对卷烟烟气释放的影响开展了相关研究，Irwin［4］、Egilmez［5］、Debardeleben等［6］、Yamamoto等［7-8］研究了烟支圆周对烟气常规成分、部分挥发性成分以及烟气气溶胶粒径的影响，葛畅等［9］、黄延俊等［10］、杨松等［3］、朱瑞芝等［11］、邓其馨等［12］和李超等［13］分别研究了不同圆周对烟支烟气常规成分和部分香味成分释放的影响。这些研究更多是针对卷烟烟气中常规成分，且分析指标数量相对有限，统计手段亦较为单一，不足以全面反映圆周因素对卷烟挥发性成分释放整体的影响情况。

近年来，代谢组和挥发物组等组学技术采用多元统计分析算法，在食品领域的成分差异分析［14-15］、品质分级［16-18］和掺杂掺假检测［19-20］等方面应用广泛，对于自变量远多于样品数量的统计分析呈现明显技术优势，为不同圆周卷烟烟气挥发物组差异性研究提供了技术借鉴。为此，本研究中以10个不同产区和部位单等级烟叶为对象，分别卷制常规粗支、中支和细支成品烟支，采用GC-MS法对不同圆周组卷烟主流烟气中307个挥发物进行检测，结合组学手段采用的化学计量学方法，筛选差异化合物，系统对比分析圆周对卷烟烟气挥发性成分释放量的影响，旨在从分子水平剖析不同圆周烟支烟气释放特征的差异，为中支和细支卷烟产品开发及品质提升提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

选用八大产区及不同部位烟叶为实验材料：福建三明（武夷丘陵生态区，清甜蜜甜香型，中部）、贵州遵义（黔桂山地生态区，蜜甜香型，中部）、重庆武隆（武陵秦巴生态区，醇甜香型，中部）、湖南郴州（南陵丘陵生态区，焦甜醇甜香型，中部）、福建三明（武夷丘陵生态区，清甜蜜甜香型，上部）、福建三明（武夷丘陵生态区，清甜蜜甜香型，下部）、云南玉溪（西南高原生态区，清甜香型，中部）、河南洛阳（黄淮平原生态区，焦甜焦香型，中部）、山东临沂（沂蒙丘陵生态区，焦香蜜甜香型，中部）和吉林白城（东北平原生态区，木香蜜甜香型，中部）10个单等级烟叶，选取市场在售某品牌粗支、中支和细支卷烟的常用辅材参数，将上述烟叶样品分别上线卷制成粗支、中支和细支卷烟（对应编号分别为CZ、ZZ 和XZ，样品卷制在江苏中烟工业有限责任公司下属卷烟厂完成，不加香加料）。

氘代苯标准品（≥99.5%，内标，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）；乙酸苯乙酯标准品（≥99.5%，内标）、反-2-己烯酸标准品（≥99.5%，内标）、N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［N，O-Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA，色谱纯］（美国Aldrich 公司）；二氯甲烷、甲醇（色谱纯，美国J&T Baker公司）。

7890B-5977A型气相色谱-质谱联用仪、DB-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μ m）、DB-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×1.0 μm）、DB-624弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×1.4 μm）（美国Agilent 公司）；SM450 直线型吸烟机（英国Cerulean 公司）；有机相针式滤器（孔径0.45 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）；剑桥滤片（直径44 mm，德国Borgwaldt 公司）；CP224S 型电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 卷烟烟气常规成分释放量的测定

按照GB/T 16447—2004 的要求，将不同圆周样品卷烟在温度（22±1）℃、相对湿度（60±3）%的环境中平衡48 h，然后按照（平均质量±0.15）g和（平均吸阻±30）Pa的标准挑选测试样品。参考标准方法［21-24］分别分析主流烟气总粒相物、焦油、烟碱、水分和CO的释放量，不同圆周卷烟实验结果的平均值见表1。参照文献［25-26］的方法分别进行卷烟主流烟气挥发性和半挥发性成分分析。

表1 不同圆周卷烟烟气常规成分释放量测试结果Tab.1 Releases of routine smoke components from cigarettes with different circumferences（mg·支-1）

1.2.2 数据处理

使用质谱仪器Agilent MassHunter 定量软件处理采集的SIM 数据，利用编辑好的自动积分方法，生成一个包含样品信息、成分名称和释放量的样品数据矩阵，采用半定量方法测定释放量，以目标物峰面积与内标峰面积的比值计。利用SIMCA-P 14.1 软件对数据矩阵中心化和归一化处理后进行主成分分析（Principal components analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）和变量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）值分析，并利用SPSS 26.0 软件进行方差分析，筛选出组间存在显著性差异的化合物；采用Graphpad prism 7.0软件绘制挥发物组释放量分布图；采用Bioladder（https://www.bioladder.cn）在线方式绘制火山图；采用Origin 2022 软件绘制箱线图；采用Metaboanalyst（http://www.metaboanalyst.ca）和Omicshare（https://www.omicshare.com）在线方式分别绘制聚类热图和网络相关性热图。

2 结果与分析

2.1 不同圆周卷烟主流烟气挥发物释放量整体对比分析

利用GC-MS 工作站MassHunter 定性软件解卷积功能对共流出峰进行解析，并运用NIST17 和FLAVOR2数据库进行检索（匹配度大于85%），同时结合保留指数对卷烟烟气中挥发性化合物进行定性分析。经查证、确认共鉴定出307个化合物，按官能团分类主要包括烃类化合物8个、醇类16个、酚类25个、醚类4个、醛类27个、酮类66个、酸类44个、酯类26个、内酯类22个、酸酐类2个、酰胺类9个（内酰胺1 个和酰胺及酰亚胺8 个）、含硫化合物7 个，以及含氮杂环类化合物51个（吡啶类19个、吡咯类8个、吡嗪类16个、呋喃类3个、喹啉类1个、咪唑类2个和吲哚类2个），共20类挥发物组。不同圆周卷烟烟气中挥发物释放量统计结果和挥发物组释放量整体分布情况分别如表2和图1所示。

图1 不同圆周卷烟烟气中不同类挥发物组释放量整体分布情况Fig.1 Overall distributions of different types of volatile components released in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

表2 不同圆周卷烟主流烟气挥发物释放量统计结果Tab.2 Statistical results of volatile components released in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

结合表2 和图1 结果对不同圆周卷烟主流烟气挥发物释放量进行整体对比分析。就官能团分类而言，不同圆周卷烟烟气中挥发性组分释放量分布呈现出类似的趋势，即醚类、酯类、酸酐类、内酰胺类、酰胺及酰亚胺类、含硫化合物、吡咯类、呋喃类、咪唑类、吡嗪类、吲哚类和喹啉类化合物的释放量整体较低；烃类、醇类、内酯类和吡啶类化合物的释放量处于中间水平；而酚类、醛类、酮类和酸类化合物的释放量整体较高，其中，酸类化合物的释放量最高，酚类、酮类和醛类化合物依次减小。进一步分析每类化合物释放量分布离散情况可知，烃类、酚类、醛类、酮类、酸类、酯类、酸酐类、内酰胺类、酰胺及酰亚胺类、吡咯类、呋喃类、咪唑类、吡啶类和吲哚类等挥发物组，波动趋势由大到小依次为CZ、ZZ、XZ 样品。田海英等［27］在研究圆周与酚类化合物释放量的变化时也得到了类似规律；含硫化合物、吡嗪类和喹啉类等挥发物组，波动趋势由大到小依次为CZ≈ZZ、XZ样品；醚类和内酯类等挥发物组，波动趋势由大到小依次为CZ、ZZ≈XZ 样品；醇类挥发物组，波动趋势由大到小依次为CZ、XZ、ZZ 样品。可见，总体上不同圆周卷烟挥发物组释放量分布离散趋势由大到小依次呈现为CZ、ZZ、XZ样品的规律特征。

就圆周条件对不同类挥发物组释放量影响情况而言，醇类、酚类、醚类、酯类、酸酐类、酰胺及酰亚胺类、咪唑类、吡啶类和吲哚类9 类挥发物组，CZ 与ZZ、XZ 样品之间释放量均具有明显差异，但ZZ 和XZ 样品之间差异不明显；吡咯类和呋喃类化合物，CZ 与XZ 样品烟气释放量差异明显，但ZZ 与CZ 和XZ样品烟气释放量均不具有明显差异；醛类和吡嗪类化合物，CZ 和ZZ 样品之间差异不显著，但均与XZ 样品之间具有显著差异；而烃类、酮类、酸类、内酯类、内酰胺类、含硫化合物和喹啉类7类挥发物组，CZ、ZZ 和XZ 样品两两之间烟气释放量均具有显著性差异。由以上结果可知，不同圆周卷烟中，CZ 与XZ样品之间烟气挥发物组释放量均存在显著差异，而ZZ 样品居中，总体上呈现与CZ 样品间差异显著大于与XZ样品间的情况。

2.2 卷烟主流烟气挥发物绝对释放量差异分析

2.2.1 PCA和OPLS-DA分析

在对不同圆周卷烟主流烟气中挥发物组释放量整体差异分析基础上，以CZ、ZZ和XZ 3组卷烟样品中307 个组分为自变量，采用无监督的PCA 进行分析，结果如图2a所示。可知，在95%置信区间内，PC1 和PC2 的贡献率分别为64.1%和14.8%，两者的总贡献率为78.9%，表明PC1和PC2基本上可以反映不同圆周样品间挥发性化合物释放情况差异。在PCA 3 个区域中，ZZ 和XZ 样品区域较为紧密地聚集在一起，CZ样品区域表现出一定程度的分散。总体显示粗支卷烟与细支卷烟能够完全分开，而中支卷烟分布位居其中，但是有少部分样品与细支卷烟混合在一起，没能完全分开，这与上节中不同圆周卷烟按官能团分类得到的分析结果差异一致。

图2 不同圆周卷烟主流烟气中挥发性成分的PCA和OPLS-DA得分图Fig.2 PCA and OPLS-DA score plots of volatile components in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

为进一步分析不同圆周卷烟间烟气中的差异化合物，采用有监督的OPLS-DA 方法对数据进行处理。图2b 至图2d 是OPLS-DA 分析结果，经过200次置换检验，模型评价参数结果如表3所示。从图2中可以看出，CZ、ZZ 和XZ 样品之间分别两两比较，从横坐标方向看，不同圆周样品之间分离均明显，显示能够区分不同圆周卷烟样品；从纵坐标方向看，不论何种圆周卷烟，组内样品较为分散且均没有簇拥聚集，能够推测出由于配方烟丝内在组分含量存在差异，进而带来烟气挥发物成分释放量各异。表3中结果显示，3个模型的拟合参数R2X、R2Y和Q2总体上均趋近于1，且Q2在Y 轴的截距<0，说明模型不产生过拟合，表明模型有稳健良好的解释和预测能力。通过与主成分分析相比，CZ、XZ和ZZ样品均呈现聚类分布，不同样品间差异显著，表明不同圆周卷烟之间可以通过OPLS-DA 方法进行烟气差异化合物分析。一般VIP值大于1.0且P值小于0.05的化合物被认为是有助于分类区别的潜在差异化合物［28］，结果显示，CZ vs ZZ、CZ vs XZ 和ZZ vs XZ 之间分别存在35个、12个和12个差异化合物，这些化合物可作为区分不同圆周卷烟烟气释放物差异的特征标志物。

表3 不同圆周卷烟OPLS-DA模型评价参数和差异化合物数量Tab.3 Evaluation parameters and differential compound numbers of OPLS-DA models for cigarettes with different circumferences

2.2.2 差异化合物的分布

在初步筛选不同圆周样品间差异化合物的基础上，进一步采用火山图形式，探讨差异化合物在不同圆周样品间的分布情况［29］。以化合物释放量的倍率（Fold change，FC）对数为横坐标、P值对数为纵坐标，当化合物落在FC>1 且P<0.05 区域时，表示该化合物释放量显著增加，即显示与对照组相比，实验组中该化合物是上调的（以红色圆点标明）；当化合物落在FC<1 且P<0.05 区域时，表示该化合物的释放量显著降低，即显示与对照组相比，实验组中该化合物的释放量是下调的（以绿色圆点标明）。

如图3a所示，相比于CZ 卷烟，XZ 卷烟中有D10（丙二醇）、M21（己醛）、J3（2，5-二甲基呋喃）、P1（对伞花烃）、P4（2，6-二甲基-2，6-辛二烯）、Q23（2-己酮）、Q25（2-戊酮）、Q26（2-辛酮）、Q55（甲基异丁基酮）和T2（2，2，4-三甲基戊二醇异丁酯）等34 个化合物的释放量下调，而只有N4（2-甲基己酸）1 个化合物的释放量是上调的；如图3b所示，相比于ZZ 卷烟，XZ 卷烟中有G3（4-硫代戊醛）、M6（3-甲基-4-羟基苯甲醛）、M21（己醛）、P4（2，6-二甲基-2，6-辛二烯）、P8（月桂烯）、Q23（2-己酮）、Q25（2-戊酮）、Q26（2-辛酮）、Q39（4-甲基-3-戊烯-2-酮）、Q55（甲基异丁基酮）、T10（肉豆蔻酸甲酯）和T26（棕榈酸乙酯）12 个化合物的释放量均呈现显著降低的趋势，不存在上调化合物；如图3c所示，相比于CZ 卷烟，ZZ 卷烟中有D10（丙二醇）、J3（2，5-二甲基呋喃）、L3（3-丁叉苯酞）、M16（丁香醛）、M26（叶醛）、N34（辛酸）、P1（对伞花烃）、Q9（巨豆三烯酮3）和Q25（2-戊酮）9 个化合物的释放量显著下降，而N4（2-甲基己酸）、E9［3-（2-羟乙基）苯酚］和T26（棕榈酸乙酯）3 个化合物的释放量显著增加。总体上看，随着卷烟圆周降低，烟气中呈现显著下调趋势的化合物数量增多，其中，D10（丙二醇）、J3（2，5-二甲基呋喃）、L3（3-丁叉苯酞）、M26（叶醛）、N34（辛酸）、P1（对伞花烃）和Q25（2-戊酮）7 个化合物在不同圆周样品间呈现的变化趋势一致。

图3 不同圆周卷烟烟气差异化合物火山图Fig.3 Volcano plots of differential compounds in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

2.3 卷烟主流烟气挥发性成分单位焦油释放量差异分析

2.3.1 OPLS-DA分析

卷烟主流烟气挥发性组分释放量是由配方烟丝、烟支圆周、辅材及参数等多因素协同影响的［13，30］。为客观比较不同圆周条件下卷烟主流烟气挥发性成分释放量，采用单位焦油释放量形式进一步比较圆周对卷烟烟气挥发性成分释放量的影响。以3组卷烟样品中307种化合物的单位焦油释放量为自变量，使用OPLS-DA 方法对数据进行处理，图4a 是OPLS-DA分析结果，其拟合参数为R2X=0.979、R2Y=0.979、Q2=0.867，可以看出3 组卷烟样品能够很好地被区分，表明该模型的稳定性可靠，预测率较高。对OPLS-DA模型进行置换检验，置换次数n=200，模型的排列验证结果如图4b所示。可以看出，左侧所有的点均低于最右侧两个点，同时模型验证结果参数R2截距为0.773、Q2截距为-1.32，表明该模型较为可靠，不存在过拟合现象。因此，采用该模型进行差异化合物筛选。结合变量重要性投影（VIP＞1.0），初步筛选出45个差异化合物（图4c，VIP＞1.0为红色），并通过方差检验（P＜0.05）对其进行验证，最终筛选出29 个差异化合物，其单位焦油释放量在CZ、ZZ 和XZ 3组圆周卷烟烟气中差异显著。

图4 不同圆周卷烟烟气挥发性化合物单位焦油释放量OPLS-DA分析结果Fig.4 OPLS-DA plots of volatile components per unit tar in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

2.3.2 聚类热图分析

为了更加直观地分析不同圆周条件下烟气化合物的差异，对已鉴定出的29个差异化合物进一步进行聚类热图分析，结果见图5。可知，样品在不同圆周条件下的聚类效果较好，差异化合物大致可分为3组：第1 组是A11（3-羟基吡啶）、D10（丙二醇）、D11（丙三醇）、E4（2，4-二甲基苯酚）、E7（2-甲基苯酚）、M19（反-2-癸烯醛）、N11（γ-戊酮酸）、N12（苯甲酸）、N26（糠酸）、Q9（巨豆三烯酮3）、Q17（2，3-戊二酮）和P6（柠檬烯）12 个化合物；第2 组是D13（糠醇）、L5［2（5H）-呋喃酮］、M10（5-甲基糠醛）、M23（糠醛）、N15（丙酮酸）、Q1（丙酮醇）和Q51（二羟基丙酮）7个化合物；第3组是E21（邻苯二酚）、E25（4-羟基苯乙烯）、N29（肉豆蔻酸）、N35（亚麻酸）、N36（亚油酸）、N41（硬脂酸）、N42（油酸）、N44（棕榈酸）、Q11（2-羟基-2-环戊烯-1-酮）和Q54（甲基环戊烯醇酮）10 个化合物。这表明所鉴定出的差异化合物可用于反映不同圆周卷烟之间单位焦油释放量的差异。结合聚类热图中化合物聚合情况，第2组和第3组化合物先聚合为一个大类，由此推出相比于CZ卷烟，ZZ 和XZ 样品之间卷烟单位焦油释放量存在较小的差异。为量化这些差异化合物在不同圆周卷烟中的分布情况，以箱线图形式对其进行比较分析。如图6所示，第1 组化合物的总释放量在CZ 样本中最丰富，其随着圆周的减小呈现出先降低后升高的变化趋势，而第2组和第3组两组化合物的总释放量随着圆周减小呈现逐步升高的趋势，均在XZ样品中最丰富。可见，同一组化合物在不同圆周样品间存在显著差异，主要原因可能是圆周的变化影响了抽吸卷烟时的气流流速和烟丝的燃烧状态，导致烟气中成分的生成、过滤及扩散发生了根本性变化［31］。一般说来，消费者吸食卷烟时，烟气感官的物质基础取决于烟气中的挥发物、半挥发物组的综合效应，因此，同一配方烟丝在不同圆周卷烟中的感官效应存在差异，特别是香气质和香气量等指标，与3种圆周条件下烟气挥发物差异指标相关性密切。后续研究可针对性确认差异指标与感官质量的相关性，为卷烟叶组的调配优化提供技术支撑。

图5 不同圆周卷烟烟气挥发性差异化合物的聚类热图Fig.5 Cluster heat map of differential volatile components in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

图6 不同圆周卷烟烟气差异组群化合物单位焦油释放量的箱线图Fig.6 Box plots of differential compounds per unit tar among 3 groups in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

2.3.3 焦油与单位焦油释放量差异化合物相关性分析

采用网络相关性分析法进一步探索焦油与单位焦油释放量差异化合物之间的相互关系，该方法具有直接分析两类变量相关性的优点［32］。图7的结果可分为两个部分，左边是网络相关图，右边是相关性热图。多变量内部（差异化合物）之间的相关性通过红绿热图展示，颜色越红代表正相关性越大，颜色越绿代表负相关性越大，正方形方块越大表示差异化合物之间的相关性越强。根据图7中色块聚集情况可明显看出，上述第1 组、第2 组和第3 组中差异化合物在各自组内大都存在不同程度的正相关关系，第1组分别与第2组、第3组之间大都存在一定程度的负相关关系，而第2组与第3组之间大都存在一定程度的正相关关系。与上述聚类热图中差异化合物的聚集情况呈现一致的变化趋势。

图7 焦油释放量与不同圆周卷烟烟气差异化合物单位焦油释放量的网络相关性热图Fig.7 Heat map of network correlations between tar levels and differential compounds per unit of tar in mainstream smoke of cigarettes with different circumferences

通过连线将差异化合物与焦油因素进行逐一关联。线条颜色越红代表正相关性越强，线条颜色越绿代表负相关性越强，同时线条越粗表明P值越小，说明相关性越显著。从图7 中还可知，焦油（Tar）释放量与D10（丙二醇）、N26（糠酸）、P6（柠檬烯）和Q17（2，3-戊二酮）4 个化合物正相关，且相关性显著；与D13（糠醇）、E21（邻苯二酚）、E25（4-羟基苯乙烯）、L5［2（5H）-呋喃酮］、N15（丙酮酸）、N29（肉豆蔻酸）、N35（亚麻酸）、N36（亚油酸）、N41（硬脂酸）、N42（油酸）、N44（棕榈酸）、Q1（丙酮醇）、Q11（2-羟基-2-环戊烯-1-酮）、Q51（二羟基丙酮）和Q54（甲基环戊烯醇酮）15个差异化合物负相关，且相关性显著。总体上看，与焦油释放量正相关的化合物大多位于第1组，而呈负相关性的化合物大多位于第2组和第3 组，这与前述显著差异化合物在不同圆周组间含量变化趋势成对应关系，即意味着相比于焦油释放量高的CZ 卷烟，ZZ 和XZ 卷烟烟气中第1 组组分的释放量整体偏低，而第2组和第3组组分的释放量整体偏高。

3 结论

（1）20 类挥发物组释放量及分散程度由大到小的顺序总体上依次为粗支（CZ）、中支（ZZ）、细支（XZ）样品，CZ与XZ之间均呈现显著差异，ZZ位居中间且与CZ之间存在显著差异的数量多于与XZ之间。

（2）就挥发物释放量而言，OPLS-DA 对不同圆周卷烟样品区分效果较好。结合VIP和FC标准，CZ与XZ、ZZ与XZ和CZ与ZZ分别筛选出上调/下调差异化合物为1/34、0/12和3/9个。

（3）基于挥发物单位焦油释放量构建的OPLS-DA 模型显著可靠，并筛选出29 个差异化合物，在不同圆周样品间呈现聚集分布，且其释放量具有显著差异。差异化合物释放量之间的相关性及其与焦油的相关性总体一致，且与差异化合物在不同圆周卷烟样品间烟气挥发物释放量的变化趋势成一定的对应关系，可为掌控不同圆周卷烟烟气释放规律，进而研发低焦油、高香气卷烟产品提供理论支撑。