再造烟叶烟气中29种有机酸的定量测定

2024-01-25李伟雪顾丽莉杨发容蔡洁云王惠平

烟草科技 2024年1期

李伟雪，顾丽莉*，杨发容，刘洋，蔡洁云，王惠平

1.昆明理工大学化学工程学院，昆明市呈贡区景明南路727 号 650500

2.云南省烟草质量监督检测站，昆明市高新开发区科医路41 号 650106

再造烟叶由烟末和烟梗等烟草废料经过一定处理后加工而成，因其在卷烟“减害、降焦、降耗”等方面的重要贡献成为卷烟产品的重要原料［1-5］，其中所含致香成分的种类和质量分数对卷烟产品的内在品质具有重要影响。有机酸作为烟草中重要的香味物质，其质量分数的高低对烟草的吸味具有重要影响，研究烟草中的有机酸对提升烟草质量，改善吸食口感具有重要作用［6-11］。

卷烟烟气的捕集常采用剑桥滤片［12-13］、静电捕集［14-15］和冷阱捕集［16-17］等方法。剑桥滤片法捕集的重复性较好，但其成本较高，分析处理复杂；静电沉降捕集法具有实验重复性好和分析时背景干扰低等优点，但该法易形成臭氧及人为产物，分析结果不准确；冷阱捕集法可减少副反应的发生且准确性较高，但要求样品中不含水分，使其应用受限。烟草中有机酸的检测方法主要有气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法［18-19］和高效液相色谱（HPLC）法［20-21］。HPLC法多用于测定难挥发性有机酸，对挥发性有机酸测定的研究较少，而GC-MS/MS 具有分离效率高、灵敏度高、分析速度快和分析范围广等优点，能够很好地分析烟草中的有机酸。因此，本研究中搭建了捕集再造烟叶烟气的全新装置，并结合GC-MS/MS建立了烟气中29种有机酸的分析方法，采用硅烷化衍生-GC-MS/MS 技术测定了不同条件下再造烟叶烟气中有机酸的释放量，对不同种类再造烟叶中的有机酸进行了比较研究，旨在为再造烟叶致香成分的开发提供检测手段和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

选取云南省烟草质量监督检测站提供的初烤烟叶及由其采用造纸法制成的再造烟叶作为实验原料，具体种类及编号：云烟87 红河蒙自C3F 烤烟（1号）；红大大理鹤庆C3F烤烟（2号）；研和上部朱砂烟9（3 号）；GP557 石林中部烤烟（4 号）；GP557 研和烤烟（5 号）；K326 红河弥勒C3F 烤烟（6 号）；NC297 红河弥勒C3F 烤烟（7 号）；云烟105 研和上部烤烟（8号）；研和中部朱砂烟9（9 号）；云烟105 陆良中部朱砂烟9（10 号）；陆良中部朱砂烟2（11 号）；云烟87 红河弥勒C3F 烤烟（12 号）；K326 玉溪红塔C3F 烤烟（13 号）；云烟87 陆良中部烤烟（14 号）；红大红河弥勒C3F烤烟（15号）；研和中部朱砂烟2（16号）；陆良上部朱砂烟2（17号）；云烟87陆良上部烤烟（18号）；云烟105 研和中部烤烟（19 号）；云烟87 研和中部烤烟（20号）；云烟100陆良朱砂烟7（21号）；云烟87玉溪江川C3F烤烟（22号）；研和上部朱砂烟2（23号）；云烟115 曲靖宣威C3F 烤烟（24 号）；云烟87 研和上部烤烟（25号）。

二氯甲烷（色谱纯，云南利妍科技有限公司）；石油醚、正己烷、乙醇、乙腈（AR，天津市致远化学试剂有限公司）；丙酮（AR，成都市科龙化工试剂厂）；甲醇（AR，天津市风船化学试剂科技有限公司）；三氯甲烷［AR，重庆川东化工（集团）有限公司］；氮气（＞99%，昆明鹏翼达气体产品有限公司）；标准品：乙酸（97.0%）、2-甲基丙酸（98.0%）、丁酸（98.0%）、3-甲基丁酸（99.0%）、戊酸（98.0%）、4-甲基戊酸（99.0%）、己酸（98.0%）、庚酸（97.0%）、十三酸（99.5%）、十四酸（99.1%）、十六酸（99.8%）、十七酸（99.5%）、十八酸（98.4%）、亚麻酸（99.0%）、亚油酸（98.9%）、甘油酸（98.5%）、3-羟基丁酸（98.5%）、反-2-己烯酸（98.0%）、N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［N，O-Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA，98.0%］、吡啶（AR）（百灵威科技有限公司）；2-呋喃甲酸（98.0%）、乙酰丙酸（97.7%）、羟基乙酸（99.5%）、苯甲酸（99.9%）、间甲基苯甲酸（99.6%）、3-羟基苯甲酸（99.7%）、十二酸（99.4%）、十五酸（99.3%）、辛酸（99.7%）、壬酸（97.3%）、癸酸（99.6%）、油酸（99.3%）、肉桂酸（99.9%）（坛墨质检科技股份有限公司）；N-叔丁基二甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（N-（tert-Butyldimethylsilyl）-N-methyltrifluoroacetamide，MTBSTFA，97.0%）、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（［N-Methyl-N-（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，MSTFA，97.0%］、三甲基氯硅烷（Trimethylchlorosilane，TMCS，98.0%）（昆明楚昊经贸有限公司）；饱和食盐水（实验室自制）。

BTF-1200C-S 型管式炉（安徽贝意克设备技术有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛市城东新瑞仪器厂）；7890B-5977A 气相色谱-串联质谱检测仪（美国Agilent公司）；BJ-800A高速多功能粉碎机（德清拜杰电气有限公司）；有机相微孔滤膜（0.22 μm，天津津腾实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 再造烟叶烟气中有机酸捕集装置的搭建

烟气捕集装置为实验室自制，装置示意图如图1所示。

图1 管式炉及烟气捕集和吸收装置示意图Fig.1 Schematic diagram of a tube furnace and smoke capture and absorption device

烟气捕集装置的特征：管式炉加热烟草原料产生烟气，从进气口通入一定流量的空气或氮气，分别提供有氧或无氧环境并将烟气吹进浸没在结冰饱和食盐水的吸收瓶中，串联两个吸收瓶以使吸收溶剂尽可能地将烟气捕集完全。

1.2.2 烟气捕集

（1）为减少称量过程中因烟叶含水率的不同而造成的实验误差，将初烤烟叶在40 ℃缓慢烘干，经高速多功能粉碎机间歇多次粉碎后，过孔径0.425 mm（40 目）筛，得到初烤烟叶粉末，即为初烤烟叶样品。将初烤烟叶粉末采用造纸法制成再造烟叶，得到再造烟叶样品。

（2）称取0.1 g 初烤/再造烟叶样品均匀铺于60 mm×30 mm的石英舟中，将石英舟置于炉管中央，盖上炉盖，按照图1将装置连接完成。

（3）有氧操作。打开进气阀和出气阀，以10 mL/min 的流量从进气口通入空气；设置升温程序，以10 ℃/min的升温速率加热至250 ℃，保持10 min，用空气吹扫60 min；以60 mL 吸收剂捕集烟气得到吸收液，将吸收液用有机相微孔滤膜过滤；取1 mL 滤液，加入150 μL BSTFA，于60 ℃衍生50 min后进行GC-MS/MS分析。

（4）无氧操作。以100 mL/min 流量的氮气吹扫捕集装置20 min 后再进行烟气捕集，除加热和吸收过程均通入氮气外，其他步骤同有氧操作。

1.2.3 GC-MS/MS分析条件

1.2.4 标准溶液的配制及标准曲线的确定

有机酸混合标准储备液的配制：分别准确称取10 mg 29 种有机酸标准品于不同的烧杯中，分别用二氯甲烷溶解后定量转移至10 mL 不同的容量瓶中，配制成质量浓度均为1 mg/mL的29 种有机酸的单标储备液。分别移取100 μL各单标储备液至同一个25 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容，得4 μg/mL 的有机酸混合标准储备液，4 ℃冷藏，避光保存。

混合内标储备液的配制：分别准确称取10 mg反-2-己烯酸和肉桂酸标准品于不同的烧杯中，分别用二氯甲烷溶解后定量转移至不同的10 mL容量瓶中，配制成质量浓度均为1 mg/mL 的内标储备液。分别准确移取100 μL内标储备液至同一个50 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，得2 μg/mL的混合内标储备液，4 ℃冷藏、避光保存。

有机酸标准曲线的确定：准确移取25、50、100、150、200、250、500、750、1 000、1 250 μL 有机酸混合标准储备液，分别置于10个10 mL容量瓶中，并各加入250 μL混合内标储备液，用二氯甲烷定容，配制成终质量浓度为10、20、40、60、80、100、200、300、400、500 ng/mL的有机酸标准溶液。各取1 mL不同质量浓度的标准溶液，加入25 μL BSTFA，60 ℃水浴衍生50 min，冷却至室温后，进行GC-MS/MS分析。

1.2.5 有机酸定量分析方法的建立

MS1 Scan扫描模式确认母离子：取高浓度有机酸标准溶液，进行MS1 Scan模式全扫描，扫描范围为35～400 amu，优化色谱条件使各化合物色谱峰分离，通过保留时间和谱库检索，确定各有机酸硅烷化产物及其保留时间，选择丰度最高的离子作为母离子。

Product ion 扫描模式选择子离子：根据MS1 Scan 扫描中确定的母离子进行Product ion 扫描，确定各有机酸硅烷化产物的时间片断和驻留时间，观察各组分母离子的子离子扫描图，选择丰度最高的特征子离子作为MRM方法的子离子。

MRM 方法的建立：对各硅烷化产物的子、母离子对分别设定不同碰撞池电压（5～60 V）的运行序列，优选各子离子的最佳碰撞能量，并采用优化的子、母离子和碰撞能量建立MRM方法。

2 结果与讨论

2.1 烟气捕集条件的优化

以有机酸种类和色谱峰面积为指标，考察了6种有机溶剂（二氯甲烷、丙酮、石油醚、甲醇、正己烷和三氯甲烷）对再造烟叶烟气捕集的吸收效果，基于所选溶剂进一步对吸收溶剂用量（30、40、50、60、70、80 mL）、气体吹扫时间（30、45、60、75、90、105 min）和加热升温速率（5、10、15、20、25、30 ℃/min）等因素进行了优化。结果表明，二氯甲烷和三氯甲烷的提取效果相较其他溶剂均较好。考虑到三氯甲烷属于易制毒有机溶剂，最终选择二氯甲烷作为吸收溶剂。二氯甲烷的体积为60 mL时对烟气中有机酸的吸收效果最好；随着吹扫时间的不断增加，有机酸种类呈现先增加后不变的变化趋势，当气体吹扫时间大于60 min 后，增加吹扫时间对吸收效果基本无影响；随着升温速率的增大，有机酸的种类呈现先增加后减少的变化趋势，升温速率为10 ℃/min时对烟气中有机酸的吸收效果最好。故最终确定的捕集条件：二氯甲烷为吸收剂、其用量为60 mL，气体吹扫时间为60 min，加热升温速率为10 ℃/min。

2.2 衍生化试剂及介质的选择与衍生条件的优化

共选择了BSTFA、MTBSTFA、MSTFA、BSTFA+1% TMCS 4 种衍生化试剂，分别选取二氯甲烷、乙腈和吡啶3种溶剂作为衍生化介质，对所选衍生化试剂分别在20、30、40、50、60、70、80 ℃的条件下衍生20、30、40、50、60、70、80 min，加入衍生化试剂的量分别为25、50、75、100、125、150、175、200 μL，采用29种有机酸的标准溶液对不同衍生条件的衍生效果进行实验，每组实验重复5次，取平均值。结果发现：①BSTFA 衍生产物的出峰干净，杂峰少，响应值较高，适合作为有机酸的衍生化试剂；②二氯甲烷作为衍生介质的效率相对其他衍生试剂和介质均较高，衍生化较完全；③衍生温度为60 ℃，衍生时间为50 min，BSTFA用量为150 μL时，衍生化效率最高。

2.3 有机酸定量分析方法的建立

按照1.2.5 节所述进行质谱条件的优化，确定每种有机酸对应的母离子和子离子，并对碰撞能量进行优选，建立了MRM方法。优化后的具体质谱扫描参数见表1，29种有机酸的分离色谱图见图2。

表1 有机酸的质谱扫描参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for the target organic acids

图2 29种有机酸的分离色谱图Fig.2 An example of a separation chromatogram of the 29 organic acids

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线及检出限（LOD）和定量限（LOQ）

采用内标法定量，以各目标物的色谱峰面积与内标峰面积之比对各目标物浓度进行线性回归分析，得到各目标物的标准曲线回归方程及线性相关系数。将最低浓度标准工作溶液重复进样10次，计算其标准偏差，分别以3 倍和10 倍标准偏差为方法的检出限和定量限，结果见表2。

表2 29种有机酸的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限Tab.2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients,limits of detection（LOD）and limits of quantification（LOQ）for the 29 organic acids

表2 表明，在所测定的浓度范围内，有机酸标准曲线的相关系数大多在0.995 以上，线性关系良好，检出限和定量限分别在0.83～17.57 ng/g 和2.77～58.56 ng/g范围内。

2.4.2 加标回收率和精密度实验

选择某一再造烟叶样品，按照1.2.2 节所述方法进行烟气捕集和检测前处理，分别添加不同水平（本底量的约0.5、1.0、2.0倍）的有机酸标准溶液，每个添加水平下分别制备6个平行样品，采用建立的MRM方法分析；根据各组样品中各有机酸的测定结果，计算方法的加标回收率和精密度。结果发现，各有机酸的加标回收率在85.68%～108.32%范围内，RSD值在1.19%～7.66%范围内。这表明该方法的回收率较好，适用于烟草中有机酸的定量测定。

2.4.3 重复性实验

对同种再造烟叶样品采用建立的MRM 方法进行6 次平行测定后，计算其相对标准偏差。结果显示，29种有机酸的RSD值在0.63%～5.37%范围内，表明该方法的重复性较好。

2.5 实际样品的检测

2.5.1 有氧和无氧氛围下再造烟叶烟气中有机酸成分的对比分析

依据前述方法，以25 种初烤烟叶制成的再造烟叶为原料，分别在有氧和无氧氛围下对其烟气中的29种有机酸进行定量分析，结果如图3所示。

图3 有氧和无氧氛围下25种再造烟叶样品烟气的有机酸总质量分数Fig.3 Total mass fractions of organic acids in smoke from 25 reconstituted tobacco samples detected in aerobic and anaerobic atmosphere

图3 显示，25 种再造烟叶样品烟气的有机酸总质量分数差异较大，同种再造烟叶样品烟气在不同氛围下的有机酸总质量分数也有一定差异；整体上看，有氧条件更利于有机酸的释放。这可能是氮气条件下再造烟叶只发生热解反应；而在有氧条件下，除发生热解反应外，还发生了氧化反应，很多有机酸是氧化反应的产物［22］。

2.5.2 初烤烟叶和再造烟叶烟气中有机酸成分的对比分析

依据前述方法，以25 种初烤烟叶及由其制成的再造烟叶样品为原料，在有氧氛围中对两种原料烟气中的29种有机酸进行定量分析，结果如图4所示。

图4 初烤烟叶和再造烟叶样品烟气中有机酸总质量分数的对比Fig.4 Total mass fractions of organic acids in smoke from cured tobacco and reconstituted tobacco samples

由图4 可知，整体上看，25 种初烤烟叶和再造烟叶样品加热产生的烟气中有机酸的释放量差异均较大。该差异可能是由烟叶的产地和等级不同造成的。对比初烤烟叶及由其制成的再造烟叶样品可知，25 种初烤烟叶样品烟气含有的29 种有机酸总质量分数均低于由其制成的再造烟叶样品。可见，再造烟叶的制作过程会使有机酸类成分的释放量增加。

2.5.3 不同温度下再造烟叶样品烟气中有机酸成分的对比分析

依据前述方法，以10 种初烤烟叶制成的再造烟叶样品为原料，在有氧氛围中分别加热至150、200、250、300、350、400 ℃，并用二氯甲烷对每个温度下产生的烟气捕集后进行衍生，最后采用MRM方法对29种有机酸进行定量分析。结果如图5和图6所示。

图5 10种再造烟叶样品在不同温度下释放的有机酸总质量分数Fig.5 Total mass fractions of organic acids released from 10 reconstituted tobacco samples at different temperatures

图6 有氧氛围、不同温度下12号再造烟叶样品烟气中各有机酸的释放量对比Fig.6 Releases of organic acids in smoke from reconstituted tobacco sample No.12 at different temperatures in an aerobic atmosphere

由图5 可知，随着加热温度的升高，再造烟叶烟气中有机酸的总质量分数先增加后降低。不同种类再造烟叶样品烟气的有机酸总质量分数的峰值略有差别，但均集中在250～300 ℃区间，表明在此温度区间有机酸得到大量释放。原因可能是该温度区间达到了大多数有机酸的沸点，如十二酸的沸点为299 ℃，十四酸的沸点为250 ℃。

图6为云烟87红河弥勒C3F烤烟制成的再造烟叶样品在有氧氛围、不同温度下烟气中29种有机酸的释放量对比。由图6可知，在不同温度下各有机酸间的释放量差异均较大。其中，羟基乙酸在各个温度下的释放量均为最高，甘油酸次之，乙酸、4-甲基戊酸、己酸、庚酸和壬酸等挥发性有机酸的释放量较低，辛酸及亚麻酸、亚油酸、十七酸和十八酸等高级脂肪酸的释放量较高。