冻融囊胚移植中囊胚形态学评分对妊娠结局和新生儿出生结局的影响

徐思蕾,陈 潼,张小建,孙明菡

(1.电子科技大学医学院,四川 成都 610054; 2.四川省医学科学院·四川省人民医院妇产科生殖中心,四川 成都 610072)

辅助生殖技术发展四十年来,随着囊胚培养技术和玻璃化冷冻体系的不断成熟和完善,试管婴儿的妊娠率已显著提高[1,2]。为降低多胎妊娠率、提高胚胎着床率[3],实验室囊胚培养技术在临床日益重视。胚胎基因组激活阶段是从受精后第3天卵裂期胚胎开始到囊胚形成,要真实评估胚胎发育潜能必须实现胚胎基因组从母体型到胚胎型的转变[4],发育潜能较差的胚胎在胚胎基因组激活阶段被淘汰[5]。因此普遍认为与卵裂期胚胎相比,能形成囊胚的胚胎具有更好的种植潜能,囊胚移植具有较高的着床率和活产率[6]。如何选择发育潜能更高的囊胚移植是辅助生殖技术中最主要的挑战之一。Gardner形态学评价体系是现阶段临床上用于优质囊胚筛选的主要方法[7,8],这一评价体系的形态学参数包括囊胚扩张和孵化阶段的形态、内细胞团(inner cell mass,ICM)及滋养层细胞(trophectoderm,TE)等级。越来越多的证据表明,冷冻和新鲜胚胎移植后的活产率(live-birth rate,LBR)可通过胚胎在体外达到囊胚阶段的能力来预估[9]。也有研究者对囊胚形态学等级评分在预测胚胎发育潜能中的作用价值提出质疑。有研究报道ICM和TE等级评分可作为临床上评价妊娠率和活产率的一个重要指标,对于优质囊胚而言,囊胚的TE评分越高则流产率越低[10]。猜测原因可能与胚胎滋养层细胞的功能有关,胚胎着床与着床后分化发育成胎盘部分的滋养层细胞存在密切联系[11]。但亦有学者提出囊胚扩张和孵化阶段形态、ICM等级及TE等级与早期妊娠结局和新生儿出生结局无显著相关性的观点[12]。有研究发现,双囊胚冻融移植D5,D6,D7临床妊娠率依次降低,胚胎着床率依次减少,差异均具有统计学意义[13,14]。Hiraoka等研究发现,第6、7天优囊胚冻融移植周期活产儿的性别比例、早产率、出生体重无显著性差异[15]。本研究分析我院生殖中心冻融囊胚移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)患者的临床资料,探讨FET周期中不同分级的囊胚对妊娠结局和新生儿出生结局的影响,为胚胎实验室筛选发育潜能最佳的囊胚提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料2017年5月至2021年12月在四川省人民医院生殖中心行FET的不孕患者,总计2576个周期。纳入标准:①年龄在38岁以下(包含38岁);②均行FET;③采用GnRH拮抗剂方案或GnRH激动剂降调节方案控制促排卵周期;④随访数据完整。排除标准:①严重子宫畸形明确诊断;②子宫内膜异位症、子宫腺肌症;③子宫内膜回声不均、宫腔积液、宫腔形态异常或未手术治疗的子宫内膜息肉等影响子宫内膜容受性疾病;④采用自然周期、微刺激、黄体期促排等刺激方案控制超促排卵周期;⑤供卵、供精试管周期;⑥卵子冷冻解冻周期。本研究采用的移植囊胚均处于扩张分期的3～6期。以ICM及TE的致密程度和细胞数为标准对囊胚进行分期和分级并以此划分组别,其中A组(移植≥4AA级囊胚)108周期,B组(移植4-6AB,4-6BA囊胚)370个周期,C组(移植4-6BB,4-6CA囊胚)1170个周期,D组(移植4-6BC,4-6CB,4-6CC囊胚)928个周期。本研究经四川省人民医院伦理委员会审查批准通过。

1.2 方法

1.2.1控制性促排卵方案及体外受精 控制性促排方案包括GnRH激动剂降调节方案和GnRH拮抗剂方案,以窦卵泡直径及卵巢激素水平为参考标准给予150～300 IU/d范围内的促性腺激素(gonadotropin,Gn),主导卵泡平均直径达18 mm时给予人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)。至少2个优势卵泡直径达18 mm或至少3个优势卵泡直径达17 mm以上时采用重组绒促性素(艾泽,默克雪兰诺公司,国药准字SJ20130091)250 μg或5000～10000 IU hCG(珠海丽珠医药公司,国药准字H44020642)扳机,36～38 h后行取卵术。将所有获得的卵母细胞置于37 ℃、5% O2、5% CO2的培养箱中培养。决定行IVF或ICSI中的何种受精方式需视取卵日男方精液情况而定。脱除颗粒细胞在授精后4.5 h进行并观察卵母细胞成熟度和双极(2PB)情况,若卵母细胞2PB数/MⅡ卵数在30%以下(包含30%)则进行补救ICSI (RICSI)。在受精后16～18 h观察胚胎受精情况。

1.2.2囊胚胚胎培养和评级 对处于卵裂期的胚胎培养48 h后进行观察,对第5～7天形成的囊胚采用Gardner囊胚评分标准进行分级和评估。按照囊胚腔的扩张程度可分6期:1期:早期囊胚,囊胚腔体积未达到囊胚总体积的1/2;2期:囊胚腔体积大于或等于囊胚总体积的1/2;3期:完全扩张囊胚,囊胚腔完全占据整个囊胚;4期:扩张后的囊胚,囊胚体积比早期囊胚大,透明带变薄;5期:孵出的囊胚,滋养外胚层开始从透明带裂口孵出;6期:完全孵出的囊胚,囊胚从透明带中完全逸出。按照ICM和TE的细胞数量及形态可分3个等级:A级:ICM细胞多而紧密;TE细胞多且大小均匀适中,致密排列于囊胚周围;B级:ICM细胞相对少,结合较松散,部分有整体性;TE细胞数少,松散排列在囊胚周围;C级:ICM细胞极少或近乎无细胞,并且大小不均匀,结构缺乏整体性;TE细胞极少或仅只有几个大小不均一且排列稀疏的细胞。囊胚的扩张程度在3期以上,囊胚评分在3BC/CB以上可行冷冻或移植。

1.2.3冷冻囊胚移植 采用激素替代周期方案、降调节人工周期方案及自然周期方案行子宫内膜准备。当超声提示内膜厚度8～14 mm时加孕激素转化内膜5天后行囊胚移植。移植当天解冻囊胚,采用商品化的囊胚解冻复苏液体,按照试剂盒说明进行囊胚解冻,解冻具体方法参照玻璃化解冻试剂盒(Kitatato日本)说明书进行。复苏后解冻的囊胚常规进行激光辅助孵化,然后将囊胚转移至37℃、5% O2、5% CO2的培养箱内进行2 h的培养,借助倒置显微镜观察囊胚的扩张情况并以此为依据进行分级评分。

1.3 观察指标主要包括着床率、临床妊娠率、流产率、早产率、活产率、双胎率、多胎妊娠率、异位妊娠率等。在完成囊胚移植的12天后测量血HCG,临床妊娠的诊断标准为借助阴道超声检查在囊胚移植后的28天可观察到宫内孕囊和原始胎心搏动;若在宫外可探及孕囊则诊断为异位妊娠,并记录孕囊的数目。对临床妊娠者随访至妊娠结束。

胚胎着床率=着床胚胎数/移植胚胎总数×100%;临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植总周期数×100%;异位妊娠率=异位妊娠周期数/移植总周期数×100%;自然流产率=自然流产周期数/移植总周期数×100%;双胎妊娠率=双胎妊娠周期数/移植周期数×100%;多胎妊娠率活产率=多胎妊娠周期数/移植周期数×100%,活产率=活产周期数/移植周期数×100%。妊娠满28周,胎儿娩出后有心跳、呼吸、脐带搏动、随意肌收缩4项生命指标之一者称为活产;妊娠满28周但不足37周即分娩者称为早产。

1.4 统计学方法应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用t检验或方差分析;计数资料以例数(%)表示,比较采用卡方检验;不同参数对临床妊娠率及活产率的影响采用多因素Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组患者基线资料及控制性促排卵周期比较本研究总共纳入2576个FET,四组患者年龄分别是(30.0±4.4)岁、(29.9±4.3)岁、(30.2±4.4)岁、(31.0±4.4)岁;体质量指数(BMI)分别是(21.2±2.0)kg/m2、(20.5±2.2)kg/m2、(22.7±5.1)kg/m2、(21.8±3.3)kg/m2。不同组别患者年龄、不孕年限、BMI、AMH、基础性激素水平、子宫内膜情况以及促性腺激素总量和天数进行比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 各组患者的基线资料

2.2 不同囊胚级别各组患者妊娠结局比较对各组囊胚移植后的妊娠结局进行比较发现,A组囊胚移植后的临床妊娠率最高,高于B、C、D组(P< 0.05),B组临床妊娠率高于C组和D组(P< 0.05),A组与B组间临床妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组患者的着床率比较差异有统计学意义(P< 0.05);各组异位妊娠率、早孕流产率和中孕流产率、多胎妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05)。A组与B组、A组与C组、C组与D组间的双胎妊娠率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组妊娠结局比较

2.3 冻融囊胚移植周期临床妊娠率和活产率多因素Logistic回归分析多因素Logistic回归分析结果显示,囊胚ICM和TE评分是临床妊娠率和活产率的独立影响因素(P<0.05)。见表3、表4。

表3 临床妊娠率的多因素Logistic回归分析

表4 活产率的多因素Logistic回归分析

3 讨论

随着胚胎实验室体外囊胚培养技术的日趋成熟,通过形态学评级筛选具有较高发育潜能的囊胚成为胚胎移植中非常关键的步骤。本研究纳入2576个冻融囊胚移植周期进行分析,结果显示冻融囊胚的ICM和TE评级对囊胚发育潜能、着床率、临床妊娠率和活产率方面具有一定预测价值。Gardner评分是人类辅助生殖技术实验室操作专家共识,也是目前国际上主要使用的囊胚评级方法[16]。陈梦茜等研究显示囊胚的内细胞团质量和整倍体胚胎着床率成正相关趋势,A级ICM胚胎移植着床率高于B级[10]。因此,本研究采用ICM和TE两个指标进行分组,结果提示囊胚ICM和TE评分与临床妊娠率和活产率存在密切关联且结果具有统计学意义,随着囊胚ICM和TE评分的增高,临床妊娠率和活产率亦增高。各组的着床率比较有统计学意义,随着ICM和TE评分增加,着床率下降。然而,流产率相关指标的比较在各组中均无统计学意义。由此提示,在囊胚移植中囊胚的ICM及TE评分可作为妊娠结局和囊胚发育潜能的重要预测指标之一,但在囊胚分级相差不大的组间比较中,囊胚的ICM及TE评分作为预估发育潜能的指标并未显示出其优势。说明囊胚的内细胞团和滋养细胞层评分对于冻融囊胚移植后妊娠结局的预测具有一定的参考价值。

本研究还评估了不同内细胞团和滋养细胞层评分的囊胚移植后新生儿出生结局的情况,结果显示新生儿出生性别比较A、B、C 三组无统计学差异,但A组男婴出生率高于D组。新生儿出生体重A、B、C组间比较无统计学差异,但A组新生儿出生体重低于D组。由此提示,在冻融双囊胚移植中,对于ICM和TE评级均为A的囊胚与ICM和TE评级为 BC/CB/CC的囊胚间的比较,内细胞团和滋养细胞层评分对于评估新生儿的性别和体重具有一定的价值,且结果显示ICM和TE评级越高,新生儿为男孩和体重低的概率可能越,可能考虑优质囊胚移植着床率高,继续妊娠率高,双胎妊娠早产率略高于足月妊娠,因此低体重儿增加趋势。然而,对于ICM和TE评级相差不大的组别间新生儿性别和体重的评估,内细胞团和滋养细胞层评分在本研究中并未得到有统计学意义的结果,未来需要进一步探究。

关于囊胚扩张程度是否会影响冻融囊胚移植后的妊娠结局和新生儿出生结局仍存在争议。但本研究Logistic回归分析结果显示,囊胚扩张程度不能作为临床妊娠率和活产率的独立影响因素(P>0.05)。据此我们认为在对优质囊胚的研究中囊胚的扩张程度不会对囊胚移植后的妊娠结局产生重大影响。

综上,在FET中囊胚的ICM及TE评分尤为重要,是临床妊娠率和活产率的独立影响因素,对于新生儿性别和体重的评估亦有一定价值,因而可作为冻融囊胚移植后妊娠结局和新生儿出生结局预测的一个参数,为制定临床囊胚移植策略提供参考。