胰高血糖素样肽2受体基因对肝癌的预后及免疫浸润的影响

毛春虎,陈雨恒,陈 果,唐 浩,伍 刚

(1.成都中医药大学医学与生命科学学院,四川 成都 610072;2.四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆胰外科,四川 成都 610072;3.南京医科大学 a.第一临床医学院,b.第一附属医院肝胆中心,江苏 南京 210029;4.西南医科大学临床医学部,四川 泸州 646000)

据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的《世界癌症报告》2020 版数据显示,原发性肝癌是2020年全球第六大最常见的癌症,也是第三大癌症死亡原因,肝癌的全球发病率排名第五,男性死亡率排名第二[1]。肝癌也是我国导致癌症死亡的五大原因之一[2]。因此,原发性肝癌的早期发现、诊断及规范治疗对于患者至关重要。肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染、黄曲霉毒素污染的食物、过量饮酒、超重、2型糖尿病和吸烟[1]。其病因和发病机制复杂,临床对病因及发病机制的研究仍在不断地探索和深入。肝癌的治疗方式包括手术、放射治疗、化学治疗、靶向治疗等,然而限于目前的医疗水平,肝癌的治疗效果及预后不佳[3～6]。近年来,研究者通过免疫细胞浸润寻找新的治疗方法,发现免疫浸润对恶性肿瘤的发展与预后有重要意义[7,8]。胰高血糖素样肽 2 受体(glucagon like peptide 2 receptor,GLP2R)属于G蛋白偶联受体超家族,是胰高血糖素受体家族的成员[9]。人GLP2R定位于染色体17p13.3,编码550个氨基酸的G蛋白偶联受体,加工成486个氨基酸的受体[10]。研究发现,GLP2R在有限数量的肿瘤类型中的表达,包括回肠类癌[11]、胃肠道间质瘤[12]和宫颈癌症[13]。然而,关于GLP2R在肝脏肿瘤中的表达的研究较少。本研究主要采用生物信息学的方法,探讨了GLP2R对肝癌预后的影响,并更深一步研究了GLP2R对肝癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料从UCSC XENA(https//xenabrowser.net/datapages/)网站下载TCGA数据库所有肝细胞肝癌 mRNA 转录组数据,并对其进行研究分析。

1.2 方法

1.2.1泛癌中GLP2R的mRNA差异表达分析 利用Tumor Immune Estimation Resource (TIMER2.0)(http://timer.cistrome.org/)数据库,探寻GLP2R在不同癌症中肿瘤组织与正常组织间表达的差异性。

1.2.2GLP2R的差异表达分析与GLP2R的生存分析 从UCSC XENA(https//xenabrowser.net/datapages/)网站下载TCGA数据库所有肝细胞肝癌 mRNA 转录组数据。探究GLP2R在肝癌组织与正常组织中的表达的差异性,以GLP2R的中位数表达水平将肝癌患者分为高低组,绘制Kaplan-Meier生存曲线分析GLP2R表达水平与HCC预后的关系。

1.2.3GLP2R与差异基因的蛋白互作网络及其与关键基因的相关性 使用R软件(v4.2.3)对肝细胞肝癌mRNA 转录组数据进行正常组织与癌症组织的差异表达分析,筛选出log2FoldChange绝对值大于2,且P<0.05的基因作为差异基因。利用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)及Cytoscape软件(v3.7.2)探寻GLP2R与差异基因的关系,筛选出关系较为紧密的基因作为关键基因。

1.2.4GLP2R与关键基因的单因素和多因素Cox分析 对GLP2R及筛选出的关键基因做单因素与多因素Cox回归分析,探寻其与肝癌患者预后的关系。

1.2.5GLP2R与关键基因在肝癌中的功能富集分析 对GLP2R及筛选出的关键基因行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析,寻找差异基因的富集通路。

1.2.6GLP2R表达与肝癌中免疫细胞浸润的关系 利用TIMER2.0数据库,探究GLP2R与TIMER中6种免疫细胞,与CIBERSORT中22种免疫细胞的相关性,以GLP2R在肝癌中的中位数表达水平将患者分为高低组,利用CIBERSORT分析高低组免疫细胞浸润的差异性。

1.3 统计学方法采用R软件(v4.2.3)进行数据分析。Mann-WhitneyU检验分析GLP2R mRNA在肝癌组织、癌旁组织中的表达差异,Cox回归分析肝癌患者预后的危险因素,Kaplan-Meier生存曲线分析GLP2R mRNA表达水平与肝癌患者预后的关系,GLP2R mRNA表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性采用Spearman相关分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泛癌中GLP2R的mRNA差异表达为了明确GLP2R在各种肿瘤中的mRNA表达,通过使用TIMER 2.0数据库分析肿瘤组织和正常组织中的GLP2R的差异表达模式,我们的结果显示,GLP2R mRNA 表达除了在肝细胞癌中显著下调,还在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润性癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌、结肠腺癌、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺腺癌、直肠腺癌、胃腺癌、甲状腺癌及子宫内膜癌中显著下调(P<0.05)。见图1。

图1 TIMER2.0数据库中GLP2R在不同癌症肿瘤组织和癌旁正常组织的 mRNA表达水平

2.2 肝癌中GLP2R的差异表达分析及GLP2R的预后价值从TCGA 数据库中下载肝癌数据,并对GLP2R在肝癌与正常细胞表达分组比较,绘制肝癌患者的Kaplan-Meier生存曲线显示:肿瘤样本中GLP2R较正常样本表达降低(P<0.0001)。见图2。GLP2R低表达组的肝癌患者生存时间较好(P<0.05)。见图3。

图2 TCGA数据库中GLP2R在肝癌肿瘤组织和癌旁正常组织的mRNA表达水平

图3 Kaplan-Meier生存曲线分析GLP2R表达水平与HCC预后的关系

2.3 GLP2R与差异基因的蛋白互作网络及关键基因的筛选筛选差异基因,构建蛋白互作网络及筛选关键基因。使用R软件对肝癌数据集行差异分析,以log2FC绝对值大于2,P<0.05筛选得到差异基因。见图4,共1629个差异基因,GLP2R正好存在于1629个差异基因内。将1629个差异基因导入string数据库构建网络,使用Cytoscape将其可视化,见图5。筛选与GLP2R相关联的基因作为关键基因,得到6个关键基因,分别为:GLP1R、VIPR1、GNGT1、GCG、GIP、GNG4。见图6。

图4 差异基因表达火山图

图5 差异基因网络互作图

图6 关键基因网络互作图

2.4 GLP2R与关键基因的单因素和多因素Cox分析结果显示,在单因素Cox回归中,GLP2R、GLP1R、GNGT1均与预后相关(P<0.05),见表1。在多因素Cox回归中,GLP2R、GLP1R、GNGT1均为患者不良预后的独立危险因素(P<0.05),见表2。GLP2R是LIHC患者的独立预后因素。

表1 GLP2R与关键基因的单因素Cox分析

表2 GLP2R与关键基因的多因素Cox分析

2.5 GLP2R与关键基因在肝癌中的功能富集分析对GLP2R及筛选的6个基因做GO富集分析,整理出包含GLP2R的富集通路,结果如下:生物过程方面,主要富集在细胞对胰高血糖素刺激的反应,腺苷酸环化酶-调节G蛋白偶联受体信号通路,细胞对肽激素刺激的反应等过程,分子功能方面,主要富集在胰高血糖素受体活性,肽激素结合,激素结合,G蛋白偶联肽受体活性,肽受体活性,肽结合,酰胺结合等。见图7。

图7 GLP2R与关键基因在肝癌中的功能富集分析 a:GO富集分析柱状图;b:GO富集分析点图

2.6 GLP2R表达与肝癌中免疫细胞浸润的相关性本研究通过TIMER 2.0数据库,对GLP2R基因表达分别与TIMER、CIbersort中HCC中免疫细胞浸润水平行相关性分析,结果显示:GLP2R表达与TIMER中6种免疫细胞行免疫细胞浸润相关性分析,发现GLP2R表达与CD4+T细胞(Rho=0.198,P<0.05)、中性粒细胞(Rho=0.225,P<0.05)、巨噬细胞(Rho=0.323,P<0.05)、髓样树突状细胞(Rho=0.215,P<0.05)的免疫浸润水平呈正相关,见图8a;GLP2R表达与CIbersort中22种免疫细胞行免疫细胞浸润相关性分析,发现GLP2R表达与记忆静息CD4T细胞(Rho=0.156,P<0.05)、中性粒细胞(Rho=0.113,P<0.05)、M2巨噬细胞(Rho=0.169,P<0.05)、嗜酸性粒细胞(Rho=0.127,P<0.05)的免疫浸润水平呈正相关,与CD8+T细胞(Rho=-0.178,P<0.05)、活化的NK细胞(Rho=-0.113,P<0.05)、滤泡辅助性T细胞(Rho=-0.241,P<0.05)、γδ T细胞(Rho=-0.107,P<0.05)的免疫浸润水平呈负相关,见图8b。

图8 GLP2R表达与肝癌免疫细胞浸润相关性 a:GLP2R基因表达与TIMER中免疫细胞浸润水平相关性;b:GLP2R基因表达与CIbersort中免疫细胞浸润水平相关性

2.7 GLP2R不同表达水平与肝癌中免疫细胞浸润的差异性CIBERSORT分析表明,CD8T细胞、单核细胞在GLP2R低表达组患者中的比例高于高表达组(P< 0.05),而记忆静息CD4 T细胞、M0巨噬细胞、静息树突状细胞在低表达组患者中的比例低于高表达组(P<0.05)。见图9。

图9 GLP2R表达高低组与肝癌中免疫细胞浸润的差异

3 讨论

HCC全球发病率及死亡率分别列所有肿瘤的第五位和第三位[1]。越来越多的研究发现,免疫浸润对恶性肿瘤的发展与预后有重要意义[7,8]。GLP2R属于G蛋白偶联受体超家族[9],对于GLP2R在肝癌中的表达及其对肝癌预后及免疫浸润的影响的研究尚未见报道。

通过对TCGA-LIHC肝癌样本和癌旁正常样本的对比,发现GLP2R在肝癌组织的表达异常降低。通过生存分析及单因素、多因素Cox回归,发现肝癌患者中GLP2R低表达组有更好的生存期,GLP2R可以作为影响肝癌患者总生存期的独立预后因素。通过对肝癌患者免疫细胞浸润的研究发现,GLP2R对肝癌的作用可能与部分免疫细胞浸润有关。这些结果表明,GLP2R或许参与了肝癌的发生与发展,这可能与肿瘤微环境中的免疫细胞浸润有关。

GLP2R基因已定位于人类染色体17p13.3[10]。对编码人和大鼠GLP2R的cDNA的克隆表明,它是一种G蛋白连接的七跨膜结构域受体,与胰高血糖素、GLP1和GIP受体具有同源性[14]。GLP2R介导GLP2的作用,属于G蛋白偶联受体超家族,是胰高血糖素受体家族的成员[9]。根据动物研究,GLP2R主要在胃肠道的肠道神经元中表达[15,16],有实验在小鼠肝脏中发现了全长GLP2受体(GLP2R)mRNA转录物,尽管其水平远低于空肠[17]。一项使用qPCR来表征小鼠GLP2R表达的研究也表明,GLP2R在肝脏中存在表达[18]。对猪的组织研究也表明,GLP2R在肝脏中表达[19]。研究发现,在鼠类中,GLP2R主要在胃肠道中表达[20,21],且已被证明GLP2R可以通过刺激隐窝室中的细胞增殖和抑制凋亡细胞死亡来维持肠上皮的完整性[21～25]。对小鼠的实验还表明,下丘脑阿黑皮素原(POMC)神经元中的GLP2R是促进肝脏胰岛素敏感性和血糖控制所必需的[26]。POMC神经元中的GLP2R对于肝脏葡萄糖产生至关重要,POMC神经元中GLP2R选择性缺失的小鼠表现出肝脏胰岛素抵抗[27]。还有研究发现,GLP2R基因与小鼠的肝脏炎症有关,GLP2R的缺失会增加小鼠肝脏炎症的生物标志物[28]。GLP2R还与部分肝切除术后的肝脏再生有关[18]。

目前研究表明,GLP2R在有限数量的肿瘤类型中的表达,包括回肠类癌[11]、胃肠道间质瘤[12]、和宫颈癌症[13]。有研究报道,GLP2R与胃肠道癌症相关[29,30]。GLP2R转录物在人类结肠直肠癌中表达[31],GLP2R蛋白在人类结肠肿瘤中表达[32]。GLP2R被认为是通过调节结肠上皮整合而导致结直肠癌进展的关键基因类型[30]。对胃癌的研究表明,GLP2R影响胃癌患者生存时间,有潜力作为胃癌的预后标志物之一[29]。对肺癌的研究发现,GLP2R在对EGFR-TKIs或顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中高表达,GLP2-GLP2R信号可能改变细胞对药物的敏感性,这表明GLP2-GLP2R信号可能是建立癌症细胞耐药性的因素之一[33]。敲除GLP2R基因显著抑制体外胃癌细胞的增殖、迁移[34]。本研究中,GLP2R在肝癌组织相对正常组织表达较低。肝癌患者的低GLP2R表达组有较好的生存时间。

最近研究发现,免疫浸润参与恶性肿瘤的发展,且对其预后有重要意义。研究发现,GLP2R影响结肠患者的预后,且与患者肿瘤免疫状态有关[35]。还有研究表明,GLP2R在结直肠癌肿瘤样本中显著下调,且GLP2R可能在结直肠癌进展和免疫反应抑制中发挥重要作用[36]。对胃癌的研究也表明,GLP2R与免疫细胞浸润有显著相关性[29]。本研究通过对肝癌患者免疫细胞浸润的研究发现,GLP2R表达与CD8+T细胞的免疫浸润水平呈负相关。有研究表明,CD8+T细胞高浸润与肝细胞癌患者较高的生存率有关[37]。该实验结果与本研究相符。GLP2R可能与部分免疫细胞作用对肝癌患者的预后产生影响。

综上,本研究通过生物信息学方法,阐述了GLP2R基因对肝癌预后及免疫浸润的相关性。研究结果显示GLP2R基因在肝癌组织中低表达,低表达的GLP2R与肝癌患者较好预后相关。GLP2R基因可能影响HCC免疫浸润水平,GLP2R基因可作为HCC潜在的免疫治疗靶点,为肝癌患者的治疗提供新思路。