淋巴细胞主动免疫治疗对反复种植失败封闭抗体阴性患者助孕结局影响及相关因素分析

李栗妍, 马向薇, 刘星池, 张 宁, 于月新

北部战区总医院 生殖医学科,辽宁 沈阳 110016

反复种植失败的原因很多,除了遗传、内分泌、感染及解剖等以外,还有免疫因素。未知原因导致的流产大多与免疫因素密切相关,而其中具体机制仍无法确定[1]。随着生殖免疫学研究的深入,人们对妊娠免疫、免疫性不孕及反复种植失败等问题有了新的认识,已经逐渐确定了免疫因素在生殖过程中的重要作用[2]。有研究表明,复发性流产和不明原因性不孕症可能与同种异体免疫调节机制的失衡、封闭抗体缺乏等相关[3-4],淋巴细胞主动免疫治疗(lymphocyte immune therapy,LIT)可以提高封闭抗体阳性率,从而防止胚胎被母体免疫系统攻击而流产[5]。LIT是将患者配偶或第三方无关人士的淋巴细胞注入患者皮下,刺激母体的免疫耐受机制,促进封闭抗体的产生,有效阻止胚胎父系抗原被母体免疫系统攻击,保护胚胎[6],多次注射刺激还可以提高免疫记忆力,从而进一步提高再次妊娠成功的概率[7]。本研究旨在探讨LIT对反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕结局的影响,并分析其相关影响因素。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2018年1月至2020年12月北部战区总医院收治的封闭抗体阴性且反复种植失败的94例患者为研究对象。纳入标准:封闭抗体检测结果为阴性;无家族遗传性疾病及近亲婚史;患者及配偶染色体检查结果正常;患者配偶精液检查结果正常;符合《反复种植失败临床诊治中国专家共识》中反复种植失败的临床诊断[8]。排除标准:合并输卵管堵塞、子宫畸形等生殖系统器质性病变;合并生殖道感染;合并生殖系统恶性肿瘤;合并自身免疫性疾病;合并传染性疾病,无法耐受LIT或不符合LIT指征。根据患者是否愿意接受LIT,将患者纳入LIT组(n=58)和非LIT组(n=36)。患者及其家属均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 根据准备行LIT的夫妻双方的血常规、生化检验结果及家族遗传性疾病史、近亲婚史等判定是否可进行LIT。抽取供者30 ml全血,肝素钠抗凝,用淋巴细胞分离液(天津灏洋华科生物科技有限公司)、0.9%氯化钠溶液稀释并充分混匀后,缓慢加入另一新的含10 ml淋巴细胞分离液的离心管中,以2 000 r/min离心20 min。充分离心后,管中由上而下分为4层:第1层为血浆,第2层环装乳白色层为淋巴细胞层,第3层透明层为分离液层,第4层为红细胞层。小心收集乳白色淋巴细胞层并以5 ml 0.9%氯化钠溶液稀释,以2 000 r/min离心15 min,将离心底部淋巴细胞团用1 ml 0.9%氯化钠溶液涡旋混匀。取20 μl分离的淋巴细胞混悬液进行计数,处理后的淋巴细胞浓度应调整至20×106～40×106个/L,总体积为1 ml。将淋巴细胞混悬液在患者双侧前臂皮内进行多点注射,每次每点为0.3～0.5 ml。经3次LIT后,于末次治疗后7～10 d检查封闭抗体是否转阳。若没有产生封闭抗体,从第4次治疗开始,每次治疗后7～10 d检测封闭抗体,直到转为阳性。在实验取得阳性结果后,根据临床情况进行辅助生殖,并每2～3个月进行1次后续LIT,确定妊娠后至12周超声显示胎盘发育良好后可结束治疗。非LIT组患者直接根据自身情况选择合适的辅助生殖策略进行助孕。

1.3 观察指标 记录LIT组的治疗次数、封闭抗体阳性率及LIT治疗浓度,封闭抗体采用美国望岚达公司生产的人类白细胞抗原特异性IgG抗体检测试剂盒检测。比较LIT组和非LIT组的临床指标,包括:年龄、配偶年龄、体质量指数、流产次数、不孕时间,治疗前的双侧窦卵泡数和卵泡刺激素、促黄体生成素、泌乳素、雌二醇、睾酮、孕酮、抗缪勒氏管激素水平,以及辅助生殖成功率。辅助生殖成功判定:移植后14 d检查血清人绒毛膜促性腺激素符合妊娠水平、21 d超声检查观察无异位妊娠的可能、28 d超声观察存在胎心胎芽则判定为辅助生殖成功。同时,分析各临床指标与反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕结局的相关性、反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕成功的影响因素。

2 结果

2.1 LIT组治疗情况 58例患者中:11例(18.97%)治疗4次后实现封闭抗体转阳,接受LIT的治疗浓度为30×106个/ml;47例(81.03%)治疗5次后实现封闭抗体转阳,其中,28例(48.27%)接受LIT的治疗浓度为25×106个/ml,19例(32.76%)接受LIT的治疗浓度为22×106个/ml。

2.2 两组临床指标比较 两组平均年龄、配偶年龄、体质量指数、流产次数、不孕时间,治疗前的双侧窦卵泡数和卵泡刺激素、促黄体生成素、泌乳素、雌二醇、睾酮、孕酮、抗缪勒氏管激素水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。LIT组辅助生殖成功率高于非LIT组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组临床指标比较

2.3 各临床指标与反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕结局的相关性分析 年龄、配偶年龄、体质量指数、流产次数、不孕时间、卵泡刺激素、促黄体生成素、泌乳素、雌二醇、睾酮、孕酮、抗缪勒氏管激素、左侧窦卵泡数、右侧窦卵泡数与反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕结局无明显相关性(r=-0.071、-0.051、0.084、-0.031、-0.017、-0.020、-0.099、0.026、-0.004、-0.028、0.049、-0.037、-0.062、-0.113,P均>0.05)。LIT与反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕结局存在相关性(r=0.225,P<0.05)。

2.4 反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕成功的影响因素分析 接受LIT是反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕成功的影响因素(P<0.05)。见表2。

表2 反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕成功的影响因素分析

3 讨论

在临床医学实践中,反复种植失败一直都是患者和医师共同面对的难题。胚胎着床的过程十分复杂,很容易受到多种因素的影响,在胚胎移植前的任何一个环节出现问题都可能导致着床障碍[9]。尽管尚不清楚其具体的病因及机制,但是已经有研究证实了反复种植失败与包括子宫内膜容受性降低、胚胎质量、胚胎移植技巧缺陷、精神心理因素等多种因素有关[10]。优质的胚胎和良好的子宫环境是成功种植的关键,但是值得注意的是,在体外受精-胚胎移植过程中,虽然有些患者拥有优质的胚胎和正常的子宫内膜形态,但是多次移植仍然未能成功妊娠[11]。对于这些反复种植失败的患者,如果排除了染色体异常、解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染、自身免疫疾病等病因,还需要考虑免疫平衡是否遭到了破坏,导致免疫耐受下降,继而影响胚胎的存活[12]。体外受精-胚胎移植治疗周期中,为了募集更多卵泡而使用的外源性促性腺激素会产生高水平的雌二醇,从而导致患者处于性激素高生理水平状态,免疫微环境也会相应发生变化[13]。有研究发现,在雌二醇的超生理水平影响下,内膜和外周血淋巴细胞总数量,特别是自然杀伤细胞的数量会增加,这可能与反复种植失败的发生有关[14]。

随着生殖免疫学的进展,越来越多的研究发现反复种植失败与母胎免疫调节紊乱密切相关[15]。当胚胎携带父系抗原种植在母体内时,相当于进行了一次半同种异体移植,母体会将来自父亲的基因抗原视为外来异物而进行排斥,因此,胚胎会在母体内被免疫清除。如果母体的免疫系统与胚胎源性抗原形成了免疫平衡状态,那么胚胎就可以得以存活;而一旦这种免疫平衡状态被破坏了,就会导致母胎免疫失衡,从而可能导致反复胚胎种植失败或流产的发生[16]。在这个过程中,免疫学调控起着重要的作用。在正常的妊娠中,人类白细胞抗原被互相排斥,胚胎所携带的父源性人类白细胞抗原就可以刺激母体免疫系统,从而产生IgG型封闭抗体。这个抗体不仅可以与母体淋巴细胞表面抗原结合,还可以与胚胎自身的滋养细胞结合,从而阻断母体对胎儿的免疫识别和免疫反应[17]。目前,临床可以应用LIT技术对缺乏封闭抗体的反复种植失败患者进行免疫治疗,主要是通过引入患者配偶(或第三方)的淋巴细胞来刺激患者的免疫系统,从而产生具有免疫保护作用的封闭抗体[18]。当患者再次妊娠时,这些封闭抗体就可以识别胚胎上来自丈夫的抗原,并与之结合,从而产生封闭作用,防止胚胎或胎儿父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤,从而让胚胎得到保护并且进行生长发育。本研究结果显示:LIT组辅助生殖成功率高于非LIT组,差异有统计学意义(P<0.05);接受LIT是反复种植失败的封闭抗体阴性患者助孕成功的影响因素(P<0.05)。LIT用于不明原因复发性流产患者时,主要机制是淋巴细胞免疫可提高患者的免疫反应性,从而使其获得封闭抗体,同时也可提高患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的数量,并且诱导患者体内Th1/Th2平衡向Th2偏离,从而防止胚胎或胎儿父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤,产生免疫保护,从而帮助维持正常妊娠[19-21]。

综上所述,反复种植失败的封闭抗体阴性患者接受LIT可有效使封闭抗体转阳,提高辅助生殖的助孕效果。