脂肪间充质干细胞外泌体对脑创伤记忆障碍作用及机制研究

郭玲玲, 韩 晓, 陈哲远, 程 凤, 王卓君, 田孝野, 金红旭

北部战区总医院 急诊医学科,辽宁 沈阳 110016

脑创伤是由突然的外力作用导致的急性神经损伤性疾病,其病死率和致残率位居创伤首位[1]。尽管临床诊疗水平在不断提高,但部分脑创伤患者常表现出神经功能障碍,导致患者劳动能力丧失,生活质量下降,严重危害患者的身心健康。有研究报道,脑创伤导致的死亡患者占所有外伤致死性患者的30%～40%,且是导致认知功能障碍最重要的原因之一。但临床上仍缺少创伤后记忆障碍便捷有效的治疗方法[2-3]。外泌体是由细胞分泌的直径为30～100 nm的微粒,具有磷脂包膜且富含蛋白质、磷脂、mRNAs和miRNAs等生物活性分子[4-6]。有研究报道,脂肪间充质干细胞来源的外泌体可用于脑创伤,其优势在于取材方便、体积微小、低免疫原性,具有跨血脑屏障和有效转运生物分子及与靶细胞相互作用的能力[7-9]。外泌体可以经过尾静脉输送至大脑,对脑创伤后的病理生理过程发挥调控作用[10-11]。但脂肪间充质干细胞来源的外泌体通过改善神经营养因子水平减轻脑创伤认知障碍的机制仍未明确。本研究旨在探讨脂肪间充质干细胞外泌体对脑创伤记忆障碍的作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 脂肪间充质干细胞外泌体提取及鉴定 脂肪间充质干细胞购自赛业生物科技有限公司,待细胞密度约80%时,采用无外泌体培养基继续培养48 h后收集细胞上清。通过差速离心法分离外泌体,透射电镜观察、NTA检测和蛋白免疫印迹法检测CD63、TSG101表达进行外泌体鉴定。

1.2 实验动物 选取24只雄性健康SD大鼠,体质量180～220 g,购自辽宁长生生物科技有限公司。大鼠均饲养于SPF级实验室,温度维持(22±3)℃,湿度维持45%～65%,自由饮食饮水。适应性饲养7 d后,将大鼠随机分为对照组、脑创伤组、外泌体组,每组各8只。对照组大鼠不作处理,脑创伤组、外泌体大鼠采用落体撞击法建立脑创伤模型。对照组和脑创伤组分别静脉给予等体积生理盐水,外泌体组静脉给予脂肪间充质干细胞外泌体300 μg。

1.3 水迷宫实验 7 d后采用水迷宫实验评价大鼠记忆能力。实验开始后第1～5天,将各组大鼠头朝向水池壁的方向放入水中,通过分析跟踪系统记录大鼠找到平台的时间。在训练过程中,若在1 min后大鼠仍未寻找到站台,则人为引导大鼠到平台停留10 s;记录不同训练时间逃避潜伏期。实验开始后第6天,开始隐蔽站台测试,记录穿越平台次数和目标象限时间。

1.4 湿干重检测 通过10%水合氯醛麻醉大鼠,快速取得脑组织,使用滤纸擦去表面水分,置于已烤干并称重(重量为W)的载玻片上称重并记录(W1),然后置于60℃烘箱内烘烤24 h,间隔15 min重复称重以取得恒重并记录(W2)。

组织含水量=(W1-W)/(W2-W)×100%

1.5 酶联免疫吸附法 采用酶联免疫吸附法检测大鼠脑组织神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factors,BDNF)表达。将组织标本进行蛋白提取后,从已平衡至室温的密封袋中取出板条和试剂。标准品孔和加样孔均按照说明书操作。按顺序加入工作液并孵育,显色并终止后450 nm下测量吸光度。

1.6 蛋白免疫印迹法 采用蛋白免疫印迹法检测Tau、S100β、TrkA、TrkB蛋白表达情况。进行组织蛋白的提取和总蛋白测定后,将蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜上,室温封闭1 h,分别用一抗4℃孵育过夜。TBST漂洗3次,加入对应二抗室温孵育1 h。TBST漂洗3次,采用ECL Western印迹试剂盒进行化学发光检测。

2 结果

2.1 脂肪间充质干细胞外泌体提取结果 NTA检测结果显示,外泌体基本处于30～200 nm的分布范围(图1a);透射电子显微镜结果显示,能够观察到nm级膜泡形态外泌体的典型结构(图1b);蛋白免疫印迹法结果显示,在脂肪间充质干细胞上清液中提取的外泌体存在特异性蛋白-膜蛋白CD63和膜结合蛋白TSG101表达(图1c)。本研究采用差速离心法成功提取脂肪间充质干细胞外泌体。

2.2 脂肪间充质干细胞外泌体改善脑损伤程度 脑创伤组大鼠湿干比、Tau和S100β蛋白表达水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);外泌体组大鼠湿干比、Tau和S100β蛋白表达水平低于脑创伤组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 脂肪间充质干细胞外泌体改善脑损伤程度(a.湿干重检测结果;b.脑损伤相关蛋白检测代表图;c.脑损伤相关蛋白相对灰度值)

2.3 脂肪间充质干细胞外泌体改善脑创伤后远期认知功能损伤 与对照组比较,脑创伤组大鼠第2～5天逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少,目标象限时间明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与脑创伤组比较,外泌体组大鼠第2～5天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增加,目标象限时间延长,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠水迷宫检测结果

2.4 脂肪间充质干细胞外泌体增加脑内神经营养因子水平 与对照组比较,脑创组大鼠脑组织NGF、BDNF表达下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与脑创伤组比较,外泌体组大鼠脑组织NGF、BDNF表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠脑内神经营养因子水平比较

2.5 脂肪间充质干细胞外泌体调节TrkA/TrkB受体蛋白表达 与对照组比较,脑创伤组大鼠脑组织TrkA和TrkB蛋白表达下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与脑创伤组比较,外泌体组大鼠脑组织TrkA和TrkB蛋白表达提高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 脂肪间充质干细胞外泌体调节通路蛋白表达

3 讨论

脑创伤会导致脑细胞及脑组织变形、丢失,导致残疾,其临床表现个体差异性较大,一方面因为大脑结构与功能比较复杂,另一方面因为致伤原因、致伤程度和致伤病理机制复杂多变[12]。尽管脑创伤的治疗取得了明显进步,但脑创伤后记忆障碍仍经常发生,治疗手段需进一步探索。本研究发现,早期静脉注射脂肪间充质干细胞外泌体能够有效减轻脑创伤大鼠记忆损伤,其作用与降低脑水肿和损伤相关蛋白表达水平有关;此外,机制研究发现,脂肪间充质干细胞外泌体能够促进神经营养因子和其受体蛋白的表达水平。

神经营养因子是脑内合成的一种蛋白质,广泛分布于中枢神经系统,对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用,且能防止神经元受损伤后死亡,改善神经元的病理状态,促进受损伤神经元再生及分化等,在大脑学习认知能力、记忆功能中具有重要作用,是影响突触可塑性的蛋白质[13-15]。神经营养因子家族包括NGF、BDNF等。有研究报道,缺乏NGF对学习、记忆、思维、感知觉等认知功能有显著影响,血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力下降可能与NGF和BDNF减少有关[16-17],与本研究结果一致。脑创伤大鼠发生记忆障碍、神经营养因子和相应受体表达降低,可能与脑水肿导致的细胞功能异常等脑组织损伤有关。NGF通过与效应神经元细胞上的TrkA受体结合,促进感觉和交感神经元的存活和分化,加速损伤神经元细胞修复[18]。BDNF与TrkB结合后,可同时激活细胞外与细胞内的激酶瀑布效应,其对神经元细胞的保护作用涉及抗细胞凋亡,拮抗自由基及兴奋性氨基酸,稳定细胞内钙离子水平,调节基因表达及信号传递等机制[19]。脂肪间充质干细胞外泌体中富含NGF、BDNF和血管内皮生长因子等多种细胞因子。此外,外泌体中miRNA等成分还能够促进组织中NGF和BDNF的表达[20]。本研究发现,脂肪间充质干细胞外泌体可改善大鼠记忆障碍,其可能是通过外源性补充及促进内源性神经营养因子分泌而发挥作用。

综上所述,早期静脉给予脂肪间充质干细胞外泌体可调节脑创伤大鼠神经营养因子分泌及TrkA/TrkB受体,减轻大脑损伤,促进认知障碍恢复。