结直肠癌细胞在三维与二维培养环境下增殖机制研究

胡艳艳, 秦宝丽, 周 璐, 邱 月, 椰慧楠, 张欣慰

中国医科大学肿瘤医院·辽宁省肿瘤医院 1.消化内科一病区;2.胸部·食管放疗病区;3.中西医结合科,辽宁 沈阳 110042

结直肠癌是在内、外因素作用下发生的一种多基因表达失调的常见恶性肿瘤,其发病率和病死率在全球范围内居高不下,严重影响人们的身体健康和社会发展[1]。随着结直肠癌治疗靶点和药物种类逐步增加,对于其治疗药物快速筛选主要通过体外细胞培养,但在二维(two-dimensio,2D)培养环境下与三维(three-dimensio,3D)体内环境存在很大差异。2D培养条件下肿瘤细胞常呈单层贴壁生长,细胞与细胞或细胞外基质接触较少,与体内肿瘤真实的生长微环境存在差异,不能准确反映肿瘤在体内的真实生长情况[2]。3D培养技术被广泛应用于生物学和医学研究领域,尤其对于研究肿瘤微环境、肿瘤细胞生物学行为及抗肿瘤药物筛选等方面具有重要意义[3]。壳聚糖-胶原水凝胶是一种新型的3D细胞培养材料,具有良好的生物相容性和生物降解性,在组织工程、药物筛选和细胞研究等领域广泛应用[4]。OTU结构域泛素结合蛋白2(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 2,OTUB2)与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)均为结直肠癌细胞增殖及转移的关键因子,调控其表达可能为3D和2D培养差异关键靶点[5]。本研究旨在探讨结直肠癌细胞在3D与2D培养环境下增殖能力的变化及机制,为体外3D细胞培养材料改进提供理论基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SW480结直肠癌细胞购自上海细胞库。将SW480结直肠癌细胞分别进行壳聚糖-胶原水凝胶3D培养与细胞培养皿2D培养。2D培养中结直肠癌细胞系SW480培养于10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶,于37℃、5%CO2的增湿空气中培养。3D培养中首先制备壳聚糖-胶原水凝胶支架,将壳聚糖原液与胶原按质量比10∶1混合后,连续搅拌1 h,细胞培养基浸泡处理后形成水凝胶。在1 ml水凝胶中加入1×106个结直肠癌细胞于细胞培养箱中培养。

1.2 研究方法 普通光学显微镜下观察2D、3D培养条件下结直肠癌细胞形态。采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒测定细胞增殖。在96孔板中加入100 μl细胞悬液,进行相应处理后每孔加入10 μl CCK-8溶液,将培养板在培养箱内孵育2 h。采用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。将制备编码慢病毒颗粒的重组慢病毒质粒和辅助包装元件共转染SW480细胞,过表达OTUB2基因。提取蛋白后,将蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至聚偏氟乙烯膜上,于含3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中室温封闭1 h,采用OTUB2与PCNA抗体以4℃孵育过夜,磷酸盐缓冲液漂洗3次。二抗室温孵育1 h,磷酸盐缓冲液漂洗3次,应用Western印迹试剂盒进行化学发光检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3D与2D培养环境细胞形态比较 SW480结肠癌细胞在2D环境培养24 h后可圆形或卵圆形细胞贴壁,7 d后已贴壁的细胞慢慢伸展,呈短杆状。SW480结肠癌细胞在壳聚糖-胶原水凝胶3D培养24 h后呈3D球状生长,培养7 d后可见细胞数量增多,细胞球变大。见图1。

图1 不同培养条件下细胞形态观察(a.2D培养24 h细胞;b.2D培养7 d细胞;c.3D培养24 h细胞;d.3D培养7 d细胞)

2.2 3D与2D培养环境细胞增殖速率比较 3D培养环境SW480细胞增殖速率低于2D培养环境,差异有统计学意义(P<0.05)。SW480在3D培养环境培养后1、3、5、7 d的细胞增殖速率均低于2D培养。见图2。

图2 3D与2D培养环境细胞增殖率比较

2.3 3D与2D培养环境蛋白表达比较 Western blot法检测结果显示,与2D培养比较,3D培养环境培养后结直肠癌细胞系中OTUB2、PCNA蛋白表达均低于2D培养环境,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 3D与2D培养环境蛋白表达比较

2.4 3D与2D培养环境细胞转染比较 转染后SW480细胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表达、细胞增殖速率均高于转染前,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 细胞转染前后基因、蛋白与增殖率检测比较(a.Western blot结果;b～c.转染前后细胞蛋白检测;d～e.转染前后细胞基因检测;f.转染前后细胞增殖率检测)

3 讨论

癌症预后差与肠癌细胞某些基因的表达水平相关,经过早期筛查和治疗的肠癌患者预后更佳[6-8]。体外培养细胞筛查药物方法主要包括依赖传统的塑料培养板、异种培养基的2D培养方法与新兴的3D培养方法[9]。2D培养作为标准技术能够使细胞感受和应对微环境信息,方便且高效扩增。但采用2D培养扩增方法培养细胞与体内微环境相差甚远[10-11]。3D培养是指利用各种方法和材料,使细胞更接近于体内生长状况。与传统2D单层培养比较,3D培养为肿瘤细胞在体外的生长提供类似于体内生长环境的生物支撑或基质。此外,在3D培养条件下,细胞与细胞外基质间充分接触并建立相互联系[12-14]。水凝胶能够模拟细胞的体内微环境,为其生长提供基质,更有利于开展结直肠癌细胞系3D培养和生物学调控机制研究。通过壳聚糖与胶原共混制备成水凝胶支架材料,壳聚糖的引入适当增加体系中的正电荷利于细胞有效粘附,而胶原是细胞外基质成分利于细胞功能表达[15-18]。

本研究结果显示,SW480在细胞培养皿2D培养24 h后贴壁伸展,在壳聚糖-胶原水凝胶中3D培养24 h后呈3D球状生长。这提示,在壳聚糖-胶原水凝胶支架中SW480细胞能够进行类似于人体环境的生长,可进一步研究其增殖特点。本研究结果显示,3D培养环境SW480细胞增殖速率低于2D培养环境,差异有统计学意义(P<0.05)。这提示,3D与2D培养环境下肿瘤细胞增殖速度存在差异,进一步探索其差异机制能够为3D细胞培养优化和调控肿瘤细胞体内生长特点提供参考。OTUB2能够通过去泛素化酶的作用调控PCNA促进肿瘤细胞生长[19-20]。本研究中Western blot法检测结果显示,与2D培养比较,3D培养环境培养后结直肠癌细胞系中OTUB2、PCNA蛋白表达均低于2D培养环境,差异均有统计学意义(P<0.05)。这提示,3D与2D细胞增殖速率差异与OTUB2、PCNA蛋白表达有关。此外,转染后SW480细胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表达、细胞增殖速率均高于转染前,差异均有统计学意义(P<0.05)。这提示,3D环境能够影响OTUB2基因,进而调控其蛋白表达水平,影响肿瘤细胞生长速度。

综上所述,壳聚糖-胶原水凝胶3D培养条件下结直肠癌细胞增殖速率减慢,其机制与调控OTUB2、PCNA表达有关。