转化生长因子β 对口腔软组织纤维化疾病发生发展影响的研究进展

郭晶莹, 潘启源, 李 芳, 熊曼雯, 王若琳, 刘 敏

（吉林大学口腔医院牙周科，吉林 长春 130021）

纤维化疾病通常以成纤维细胞的活化和细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 的过度产生为主要表现，破坏相应器官和组织的正常结构，引起不同程度功能障碍，通常继发于组织损伤后异常的愈合反应或由感染、缺血、过敏和自身免疫反应等因素导致的慢性炎症引起［1-2］。在口腔疾病中，一些软组织病变通常表现出明显的纤维化特征，如家族性牙龈纤维瘤（hereditary gingival fibromatosis，HGF）、药物性牙龈肥大（drug-induced gingival overgrowth，DIGO） 和口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis，OSF），组织学特征均表现为上皮钉突的形成和上皮下结缔组织中胶原过度沉积［3-5］。过度沉积的胶原改变了牙龈和口腔黏膜的结构和外形，不仅会对患者的咀嚼、发音和美观造成影响，更会形成不利于患者自洁的口腔环境，从而使纤维化持续进展且会增加患者罹患牙周疾病的风险。因此，了解口腔纤维化疾病发生发展的机制具有重要意义。尽管不同组织出现纤维化的原因不同，但纤维化疾病的发生发展均与转化生长因子β（transforming growth factor- β， TGF- β） 有关。TGF-β 在纤维化组织中高表达，且其在口腔软组织纤维化疾病中发挥重要作用。本文作者就TGF-β 的活化和信号传导功能及TGF-β 对口腔软组织纤维化疾病发生发展的影响进行综述，旨在为口腔软组织纤维化疾病的病因研究和临床治疗提供参考。

1 TGF-β 的活化和信号传导

TGF-β 是一种分泌性的多功能生长因子，参与调节增殖分化、代谢凋亡、侵袭迁移和ECM 合成等一系列细胞活动，在纤维化疾病的发生发展中发挥重要作用［6］。TGF-β 有3 种亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3。TGF-β1 能够刺激成纤维细胞产生ECM，而TGF-β2 能够通过减少自身表达代偿性地调节TGF-β1 的过度产生，TGF-β3 则可以中和TGF-β1 和TGF-β2 产生的影响并抑制纤维化作用［7］。生物合成后，TGF-β 先与潜伏期相关肽（latency-associated peptide，LAP）非共价结合形成小的潜在复合物（small latent complex，SLC），再共价结合潜在TGF-β 结合蛋白（latent TGF-β-binding protein，LTBP）形成大的潜在复合物（large latent complex，LLC）［8］。大量TGF-β 以LLC 或SLC 的形式分泌并储存于ECM中。TGF-β 被激活后才可在组织中发挥各种作用。TGF-β 的激活主要涉及2 个机制：纤溶酶、凝血酶和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等蛋白酶水解切割LAP 后，由LLC 中释放活性TGF-β；细胞表面的整合素与LAP 的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD） 序列结合，传递ECM 硬化和细胞骨架变化引起的机械阻力，诱导LLC 构象的变化，导致活性TGF-β 的释放［9］。整合素也可与MMP 相互作用，将MMP定位于潜在复合物，切割LAP 后释放活性TGF-β。整合素αv（integrin alpha V，αv） 是潜伏性TGF-β局部激活的主要调控因子，其中整合素αvβ6和αvβ1分别介导纤维化病变上皮细胞和成纤维细胞表面TGF-β1 的活化［10］。此外，TGF-β 也可被血栓反应蛋白等特殊的基质蛋白或低pH、高温、辐射、剪切应力和活性氧等特定的物理及化学条件激活［11］。活化后的TGF-β 通过细胞表面的Ⅰ型TGF-β 受体（typeⅠTGF-β receptor，TβRⅠ）和Ⅱ型TGF-β 受体（type Ⅱ TGF-β receptor，TβRⅡ） 发挥作用。TβRⅡ的高亲和力使其可直接与TGF-β 结合形成受体复合物，该复合物通过磷酸化TβRⅠ近膜结构域中的丝氨酸和苏氨酸残基激活TβRⅠ，并通过TβRⅠ的丝氨酸残基进一步激活效应蛋白Smad。受体调控的（receptor-regulated，R） -Smad （即Smad2 或Smad3）与Smad4 结合形成复合体并进入细胞核，在核内与DNA 结合转录因子和辅助调控因子共同激活或抑制相关基因的表达［12］。TGF-β也可激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3 kinase， PI3K） 通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 通路等非Smad 通路［13］，这些通路既可以独立发挥作用，也能够与Smad 通路相互作用以更好地响应TGF-β信号［10］。

2 TGF-β 对口腔软组织纤维化疾病发生发展的影响

ROBERTS 等［13］通过在新生小鼠皮下注射纯化的TGF-β 成功诱导注射部位活化的成纤维细胞产生胶原蛋白，首次发现了TGF-β 在纤维化中的关键作用。随后研究［9］进一步证实TGF-β 信号通路与ECM 基因表达及纤维形成有密切关联。在口腔中，炎症细胞、上皮细胞和成纤维细胞等多种细胞均可表达TGF-β［3，14］。而TGF-β 在纤维化组织中的异常表达提示其可能是口腔软组织纤维化疾病的重要致病因子［14-15］。

2.1 TGF-β 对HGF 发生发展的影响HGF 是一种罕见的良性遗传性疾病，可单独发生或作为某些综合征的伴发症状，表现为角化牙龈组织缓慢渐进性增生，增生的程度和范围因人而异，可覆盖部分或全部牙冠［3］。最早发现的基因突变发生于SOS1（Son of sevenless-1） 基因［16］，单胞嘧啶的插入使其活性增强，通过促进大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras） 蛋白上三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP） 与二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）的交换，间接激活Ras 蛋白，进而激活并磷酸化细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路。该通路可上调TGF-β 的表达，这可能是HGF 中TGF-β 高表达的原因之一［17］。该结果与TIPTON 等［18］的研究结果一致，该研究从HGF 和正常牙龈组织中提取成纤维细胞进行培养，发现HGF 来源的细胞能够产生更多的TGF-β1 和TGF-β2。WRIGHT 等［14］对HGF 中TGF-β 亚型表达的研究显示：HGF 中TGF-β1 表达水平明显升高而TGF-β2 表达水平降低，且TGF-β1 表达水平升高可能抑制TGF-β2 表达水平降低和TGF-β3 发挥的抗纤维化作用，表明TGF-β1 是HGF 纤维化形成中的关键因子。

TGF- β1 对ECM 有双重作用。 一方面，TGF-β1 可以促进ECM 合成。HGF 患者的牙龈组织中KCNQ1 表达增强，这是一种编码钾离子（K+）通道基因，其表达增强使外向K+电流增加，促进牙龈成纤维细胞中ECM 的合成。TGF-β1 和KCNQ1 编码的通道形成正反馈回路，通过激活该通道促进ECM 积累［19］。TGF-β1 对Ⅰ型胶原的合成具有自分泌作用，即成纤维细胞自分泌TGF-β1控制胶原蛋白合成。在胶原合成过程中，单一的前胶原多肽在内质网中发生翻译后修饰，形成三螺旋链并分泌至ECM 中。这一过程涉及位于内质网中的热休克蛋白47（heat shock proteins 47，HSP47），其与Ⅰ型前胶原多肽结合防止前胶原链的过早折叠和聚集，并参与Ⅰ型前胶原多肽向ECM 的转移和分泌。TGF-β1 可促进Ⅰ型胶原和HSP47 在成纤维细胞中的表达，且Ⅰ型胶原的过度生成与HSP47的合成增加有关［20-21］。TGF-β1 还可以刺激丝氨酸-甘氨酸生物合成途径，提供增加胶原合成所需的额外甘氨酸［22］。另一方面，TGF-β 也可以抑制ECM分解。MMPs 对ECM 成分有降解作用，抑制其表达会使胶原蛋白和纤连蛋白等沉积进而引发纤维化。TGF-β 可能对MMP-1 和MMP-2 的表达改变同样具有自分泌作用，添加TGF-β1 可以使正常牙龈成纤维细胞中MMP-1 和MMP-2 表达减少，并可能通过其下游Smad 抑制MMP-1 启动子活性所介导［3，20］。 组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs） 对MMPs 具有特异性抑制作用，其与MMPs 的比值升高可造成胶原蛋白的过度沉积，TGF-β1 则可以上调其表达［17］。

TGF-β1 还可诱导肌成纤维细胞分化。肌成纤维细胞是介于成纤维细胞与平滑肌细胞之间的表型，当其被激活时能够产生大量的ECM。肌成纤维细胞的出现是结缔组织纤维化的共同特征［23］。SMITH 等［24］发现：TGF-β1 能够诱导牙龈成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，这一过程是通过激活RhoA-Rho 相关蛋白激酶（Rho associated protein kinase，ROCK） 和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK） 信号通路实现的。SOBRAL 等［25］发现：干扰素γ 能够通过上调Smad7 表达进而抑制TGF-β1 对牙龈成纤维细胞分化的诱导作用，表明Smad 依赖性通路可能也参与了这一过程。SOBRAL 等［26］在其随后的实验中通过质粒转染实现了Smad7 的过表达，进一步证实牙龈成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的过程确实有Smad 通路的参与，并且这一过程是由结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）介导的。CTGF 的启动子中包含TGF-β1 响应元件和Smad 结合位点，TGF-β1 可以通过Smad 通路或JNK1 和Rho 通路诱导CTGF 表达，CTGF 可能也作为介质在纤维化中发挥作用［27-28］。该结论与BITU 等［23］认为HGF 中肌成纤维细胞的存在可能依赖于CTGF 表达水平的结果一致。此外，自噬可能也参与TGF-β1 诱导的肌成纤维细胞分化［29］。

研究［3］显示：TGF-β1 通过增加细胞周期G1/S转变和DNA 合成及缩短细胞周期的G1期促进成纤维细胞增殖。DE 等［30］发现：TGF-β1 以自分泌方式介导HGF 成纤维细胞G1/S 期转变，应用中和抗体阻断内源性TGF-β1 的产生和抑制其活性可以明显减少HGF 中成纤维细胞的增殖，同时发现HGF成纤维细胞的增殖率明显高于正常成纤维细胞，这一结论与JOHNSON 等［31］的研究结论相反。研究者［32］认为：增殖速率的差异是由于在正常和病变的牙龈组织中存在不同表型和功能的成纤维细胞亚群，但具体原因仍需要更多研究阐明。

2.2 TGF-β对DIGO 发生发展的影响DIGO 是由于长期服用某些药物所引起的不良反应，表现为牙龈纤维性增生并覆盖部分牙冠。能够导致牙龈增生的药物包括免疫抑制剂、钙通道阻滞剂和抗癫痫药物，最常见的为环孢素（cyclosporin A，CsA）、硝苯地平和苯妥英钠。对DIGO 组织进行免疫组织化学染色发现TGF-β1 和TGF-β2 的表达水平升高而TGF-β3 的表达水平降低，证实成纤维细胞中TGF-β 表达水平与服用药物有关。TGF-β 在DIGO中具有自分泌作用，牙龈纤维化可能是TGF-β1 表达增加和TGF-β3 表达降低的联合作用［14］。并非所有服药患者均会出现牙龈增生，且牙龈增生和纤维化的严重程度也与服用药物的种类、剂量、持续时间和口腔卫生情况有相关［33］。

COTRIM 等［34］将牙龈成纤维细胞与CsA共培养发现其可促进人牙龈成纤维细胞TGF-β1表达和产生，抑制基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinases-1，MMP-1） 和 基 质 金 属 蛋 白 酶 2 （matrix metalloproteinases-2，MMP-2）表达，但对TIMP-1和TIMP-2 的表达无明显影响。CsA 还可以刺激成纤维细胞增殖并通过阻断内质网钙释放抑制成纤维细胞对胶原的吞噬作用。由于TGF-β1 可诱导内质网和线粒体的钙释放并刺激细胞增殖，因此CsA的这一作用可能是由TGF-β1 介导的。而抑制TGF-β1 的产生可调节MMPs 的表达，表明在CsA诱导的牙龈组织过度生长中，TGF-β1 可能通过自分泌抑制人牙龈成纤维细胞的蛋白水解活性，从而使ECM 累积。此外，CsA 还可诱导牙龈上皮细胞发生上皮- 间质转化 （epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。FU 等［4］发现：CsA 处理后牙龈上皮细胞的形态发生改变，EMT 标志物表达增加，而TGF-β1 抑制剂可以阻止这一过程，表明CsA 诱导牙龈发生EMT 依赖或部分依赖于TGF-β1。研究［35］显示：CsA 可诱导人牙龈成纤维细胞产生活性氧，通过抗氧化剂处理能够改善CsA引起的TGF-β1 分泌增强和牙龈增生。且活性氧可通过激活潜在的TGF-β1 并刺激细胞表达及分泌TGF-β1 来促进纤维化。提示CsA 可能通过刺激活性氧的产生而促进TGF-β1 表达和牙龈增生。因此，CsA 可通过刺激成纤维细胞增殖、抑制胶原降解、诱导EMT 和刺激活性氧的产生诱导牙龈增生，而这些过程均需TGF-β 参与。

除TGF-β 外，由苯妥英钠引起的DIGO 还可产生大量CTGF。CTGF 具有多种生物活性，能够刺激细胞增殖并且诱导Ⅰ型胶原和纤连蛋白的产生从而加剧纤维化，还可促进细胞黏附并增强细胞外配体对信号传导的响应，创造有利于纤维化形成的环境［36］。研究［37］显示：TGF-β 可上调成纤维细胞中CTGF 的表达，但对上皮细胞中CTGF 的表达无明显影响。TRACKMAN 等［38］认为：TGF-β 对牙龈成纤维细胞和上皮细胞中CTGF 的表达均有刺激作用。此外，CTGF 在DIGO 中还具有自分泌作用，持续的CTGF 自分泌能够促进结缔组织纤维化［37］。由TGF-β 作为启动因子，CTGF 作为自分泌或旁分泌信号分子维持并放大组织中成纤维细胞的反应，在组织愈合过程中发挥调节级联作用，级联水平升高会导致纤维化［36］。此外，由苯妥英钠引起的DIGO 中还具有不同于健康牙龈的炎症细胞亚群，而炎症在一定程度上可增加牙龈组织中的细胞凋亡。KANTARCI 等［39］发现：减少成纤维细胞凋亡可能对牙龈组织的纤维性增生具有促进作用，由于TGF-β1 可抑制获得性免疫反应，刺激TGF-β/CTGF 通路可能会减少牙龈炎症和成纤维细胞凋亡，从而促使牙龈增生。此外，炎症有助于基底膜的破坏，可能会导致上皮和结缔组织之间不适当的因子扩散，从而维持上皮细胞中CTGF 的表达，该过程可能也涉及EMT［40］。

钙通道阻滞剂硝苯地平能够以某种方式增强TGF-β 信号传导从而增加骨膜蛋白的表达。骨膜蛋白作为一种ECM 蛋白，可以通过与加工ECM 蛋白前体的功能性结构相互作用促进ECM 的生物合成，导致纤维化［38］。氨氯地平使牙龈组织中的白介素17A （interleukin-17A，IL-17A） 表达增加，加剧TGF-β 对EMT 的影响，通过TGF-β 刺激Ⅰ型胶原表达增加和EMT 诱导纤维化［41］。因此，EMT 可能是DIGO 中普遍存在的致病原因。

研究［33］显示：在DIGO 中有多种物质通过TGF-β 发挥作用，共同参与牙龈成纤维细胞的活化。TGF-β 在过度生长的牙龈组织中高表达可能是由炎症细胞和牙龈间充质细胞产生的因子相互干扰引起的，尤其是肥大细胞。在细胞的颗粒中储存潜在的TGF-β，经蛋白酶激活后分泌TGF-β，可能是导致牙龈过度生长的关键驱动力。研究［42］表明：肥大细胞可能对纤维化具有诱导作用。有学者［43］发现：肥大细胞有刺激成纤维细胞增殖和胶原合成的潜力，因此其认为纤维化的发生需要肥大细胞和TGF-β 等因子的共同参与。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）和内皮素1 也可由肥大细胞衍生而来。AngⅡ通过牙龈成纤维细胞中的AngⅡ 1 型受体上调TGF-β1 的表达，在牙龈成纤维细胞中通过TGF-β 和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK） 诱导胶原蛋白的产生，而TGF-β1 又可以通过激活素受体样激酶5（recombinant activin receptor like kinase 5，ALK5）和Smads 直接刺激AngⅡ1 型受体表达［44］。因此，TGF-β1 和AngⅡ可能存在自分泌环作用，TGF-β/AngⅡ通路可能协同驱动体内的纤维化反应。内皮素1 可调节TGF-β 的合成，并且可作用于TGF-β/AngⅡ通路的下游，驱动成纤维细胞活化和纤维化［33］。

2.3 TGF-β 对OSF 发生发展的影响OSF 是一种伴有疤痕形成和组织纤维化的癌前病变，通常好发于颊黏膜，在确诊3~16 年后进展为口腔癌，癌变率7%~26%［15］。组织病理学的特征性表现为口腔黏膜上皮萎缩至增生或发育不良的阶段性改变及上皮下结缔组织中胶原的过度沉积和局部慢性炎症，随着疾病的进展还会出现肌肉的退行性改变，导致患者出现张口受限等症状［5］。引起OSF 最常见的原因是咀嚼槟榔。咀嚼槟榔时，槟榔粗糙的纤维会引起口腔黏膜组织的微创伤，从而继发上皮组织炎症，激活T 淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子，其中包括在OSF 发生发展中发挥重要作用的细胞因子TGF-β［45］。

TGF-β 能够通过激活COL1A2、COL3A1、COL6A1、COL6A3 和COL7A1 等前胶原基因，明显增加胶原蛋白的产生，同时也可通过激活TIMP基因和纤溶酶原激活物抑制剂来阻止胶原降解［5］。此外，在OSF 中发挥重要作用的蛋白酶和基质交联酶也受到TGF-β 的影响。OSF 中主要的蛋白酶包括赖氨酰氧化酶和转谷氨酰胺酶2，赖氨酰氧化酶能够催化胶原蛋白和弹性蛋白前体中的赖氨酸残基形成醛，而转谷氨酰胺酶2 能够催化转酰胺基酰基转移酶反应，使胶原纤维的交联发生改变，增加胶原的降解抗性，使基质稳定进而导致纤维化［46］。

MOUTASIM 等［47］发现：槟榔的主要成分槟榔碱在口腔角质形成细胞中通过毒蕈碱型乙酰胆碱受体M4上调αvβ6的表达，αvβ6与TGF-β1和TGF-β3 的亮氨酸氨基肽酶（leucine arylamidase，LAP） 结合，促进TGF-β 活化。活化后的TGF-β1 诱导肌成纤维细胞转化并上调与组织纤维化相关基因的表达，导致ECM 积聚，促进OSF 的发生发展。此外，HSIEH 等［48］发现：槟榔碱可使颊黏膜成纤维细胞中的线粒体产生活性氧，细胞氧化还原状态的改变和氧化应激的增加促进了TGF-β 的激活。潜在的TGF-β1 被活性氧激活后可能通过间变性淋巴瘤激酶（anaplastic，ALK）5、JNK 和p38/MAPK通路刺激CTGF 的合成［49］。咀嚼槟榔引起的颊黏膜微创伤和过度激活的凝血级联反应也通过活性氧途径介导CTGF 等次级介质合成，发挥促纤维化作用。由此可见，槟榔碱/活性氧/TGF-β 通路可能成为预防和治疗OSF 的新靶点之一。尽管角质形成细胞是TGF-β1 的主要来源，但异常表达的TGF-β1 也可由成纤维细胞产生。有研究［15］显示：在无刺激因素存在或上皮受损的情况下，成纤维细胞无法表达更高水平的TGF-β。αvβ6可以激活TGF-β，因此上皮来源的TGF-β1 与αvβ6共同参与OSF 组织中成纤维细胞的活化，表明上皮细胞可能也是OSF 组织中异常表达TGF-β 的重要来源［47］。KHAN 等［46］发现：槟榔及其主要成分多酚和生物碱对上皮细胞中TGF-β 通路具有诱导作用，而其对成纤维细胞中促纤维化基因的表达几乎无直接影响，上皮细胞中由槟榔诱导产生的TGF-β 通过诱导胶原蛋白等ECM 成分产生对成纤维细胞发挥促纤维化作用。PANT 等［50］发现：槟榔碱与TGF-β 协同活化成纤维细胞，促进纤维化基因表达。但槟榔碱不能引起成纤维细胞中TGF-β 及其受体的改变，表明其作用于上皮后诱导TGF-β 的分泌，再作用于成纤维细胞。提示槟榔通过TGF-β 发挥作用，EMT 可能也在OSF 的发生发展中发挥作用。

3 总结与展望

目前，关于以HGF、DIGO 和OSF 为代表的口腔软组织纤维化疾病的病因及其致病机制尚未完全阐明。口腔软组织纤维化疾病发生发展过程中重要的促进因子TGF-β 主要通过刺激前胶原基因等纤维化相关基因增加ECM 的合成，同时通过抑制蛋白酶的表达和改变胶原交联减少ECM 的降解和诱导组织中的成纤维细胞活化，并分化为肌成纤维细胞及诱导上皮细胞发生EMT，使上皮细胞和结缔组织相互作用进而发挥其致病作用。

TGF-β 在口腔软组织纤维化疾病中的作用具有个体和组织特异性。TGF-β 同时也是成纤维细胞中蛋白质翻译和营养吸收的有效刺激因子，可增加葡萄糖消耗和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP） 合成速率，且TGF-β 介导的胶原沉积和肌成纤维细胞分化伴随葡萄糖摄取、糖酵解代谢和氨基酸生物合成途径的激活［22］。

综上所述，不同组织中TGF-β 的具体来源及其活化的具体机制、诱导纤维化的靶细胞类型和具体通路等方面还需大量的研究进一步阐明，该过程中糖代谢的改变也是未来重要的研究方向。