体外人多能干细胞向间充质样细胞分化、鉴定和纯化方法的研究进展

王成刚, 李生振, 史嘉敏, 周 平

（1. 兰州大学口腔医院颌面外科，甘肃 兰州 730000； 2. 甘肃省牙颌面重建与生物智能制造重点实验室，甘肃 兰州 730000； 3. 兰州大学生命科学学院动物学与生物学系，甘肃 兰州 730000）

肿瘤、创伤和先天畸形引起的组织器官丧失通常采用移植技术进行修复，但在临床实践中，存在组织来源有限、二次手术、免疫原性和伦理道德等诸多问题。近年来，组织工程技术的快速发展实现了骨、软骨和肌腱等多种器官的再生，为临床治疗带来了新的思路［1］。种子细胞是组织工程技术三大基本要素之一，目前最常用的种子细胞为多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）［2］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 是一种经典的PSCs，分布于脂肪、脐带和纤维组织等组织和器官中［3］。MSCs 来源于胚胎早期中胚层和外胚层，具有在体内外分化为三胚层谱系细胞的能力，如骨骼、软骨和脂肪［4］。同时，MSCs具有较强的扩增能力，使其成为再生医学和组织工程中应用最多的种子细胞。MSCs 还参与免疫调节、抑制炎症、组织修复和分泌细胞生长因子等生命过程［5-6］。研究［7-8］表明：MSCs 具有修复骨关节炎软骨、修复创伤缺损、治疗冠状动脉疾病和治疗移植后并发症等功效，在基础研究及临床治疗方面具有广阔的应用前景。但人体来源的MSCs 存在取材不便、来源有限和容易老化等缺点，限制了其应用。

MSCs 也可由人胚胎干细胞 （human embryonic stem cells， hESCs） 或人诱导PSCs（human induced PSCs，hiPSCs） 诱导分化为人PSCs 来源间充质干细胞（human PSCs-derived mesenchymal stem cells，hPSCs-MSCs）［9］。hESCs是受精3~6 d 后胚胎内的正常细胞，主要来源于囊胚内细胞团，早期体外培养hESCs 需破坏胚胎，存在伦理问题。研究者［10］在化学成分明确的培养基中诱导体外受精胚胎的卵裂球单细胞分化为hESCs，且不会引起胚胎破裂，因此由hESCs 向MSCs 分化的研究成为了热点。hiPSCs 与hESCs 相似，是由人体细胞经重编程技术编辑得到的一类高度未分化细胞，其来源广泛，具有自我更新及多向分化潜能，且不具有免疫原性［11］。hPSCs-MSCs具有与成体MSCs 相似的组织学特点和功能，有效克服了成体MSCs 的不足，其体外增殖能力强、来源丰富且免疫原性风险低，因此具有重要的科学研究意义和临床应用价值［12］。但hPSCs-MSCs 也存在诱导效率低和鉴定标准不明确等问题。现就hPSCs-MSCs 的分化、鉴定和纯化方法进行综述，分析目前存在的问题和不足，并展望其应用前景，以期为hPSCs-MSCs 在组织工程中的应用提供理论依据。

1 hPSCs 向间充质样细胞分化方法

1.1 hPSCs 向间充质样细胞分化将hESCs 和hiPSCs 向MSCs 进行诱导分化目前已经过多次尝试。2005 年，BARBERI 等［13］报道：将hESCs 与小鼠骨髓基质细胞OP9 共培养以促进其间充质向分化，共培养40 d 后，采用流式细胞术分离得到CD73+细胞，于含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的基础培养基中培养1~2 周，诱导获得具有成纤维细胞样形态表现且阳性表达MSCs 表面标记物的细胞，即间充质样细胞。随后，收集hPSCs 培养过程中分化的细胞和使用间充质培养基诱导分化的方法被广泛应用。

为了提高诱导分化效率，研究［14］对诱导分化的过程进行了优化，分为拟胚体（embryoid bodys，EBs）法和单层法。hPSCs 细胞团在悬浮培养过程中形成EBs，并可模拟体内胚胎发育过程，自发分化为三胚层细胞，其中中胚层细胞和外胚层细胞可进一步分化为间充质样细胞。XU 等［15］采用EBs 法获得hESCs-MSCs，将H1 hESCs 消化为小团块并于超低黏附培养板中悬浮培养4 d 后获得EBs，将EBs 转移至明胶包被培养板上培养，将EBs周围爬出细胞连续传代，获得间充质样细胞；悬浮培养5、 7、 10 或14 d 亦可获得hPSCs-MSCs。SHEYN等［16］利用从EBs 中爬出时间差异获得2 种间充质样细胞，均具有多向分化潜能，且早期爬出的细胞具有更强的成骨分化能力。

将干细胞培养基中已自发分化的间充质样细胞转移至MSCs 培养基中纯化，以获得足够数量的细胞，称为直接诱导法或单层法。不同实验在此基础上进行改进，以提高实验效率。OLIVIER 等［17］在使用单层法培养hESCs 的过程中，去除培养基中维持细胞干性的因子以促进细胞分化，将hESCs克隆边缘或中央自发分化的细胞机械分离出来，于DMDM+10% FBS+1% 青-链霉素+1% 非必需氨基酸的D10 培养基中培养4 周以上，直至形成较厚和多层的上皮细胞样结构，分离该结构即可得到MSCs。该方法具有不需要滋养层细胞和避免异种细胞污染的优点，但手工挑选缺乏客观标准，MSCs 中可能混有其他细胞。研究［18］通过延长干细胞培养基的换液时间以提高hESCs 的自分化效率，或直接采用间充质培养基，简化实验步骤，从而提高获得MSCs 的效率。ESCs 培养于含FBS 和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth facto，bFGF）的间充质培养基中，培养后可获得大量hESCs-MSCs［19］。LIAN 等［20］在DMEM 中添加血清替代物（serum replacement，SR）、bFGF和血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）培养hESCs 1 周，获得与MSCs 类似形态和表面标志物的细胞，且具有多向分化能力。然后在上述培养基中添加了表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），诱导hiPSCs 分化为MSCs［21］。该方法的优点是可采用不含滋养层和不含血清的培养基诱导获得MSCs，避免了外源性细胞污染的可能。尽管直接诱导法获得MSCs 较为方便且实验过程简单，但存在分化周期长、分化效率低和无法模拟体内胚胎发育过程等问题。

近年来，经三维培养获得hPSCs-MSCs 的方法受到关注。YAN 等［22］将消化后的hESCs 置于含Y-27632 的mTeSR1培养基中悬浮培养，经BMP4 和A83-01 诱导分化及MSCs 培养基培养后，于第20 天消化获得MSCs 微球。研究［23］显示：与二维培养比较，三维培养的MSCs 活性更强，并有较好的血管生成能力、抗炎能力和组织再生能力。

1.2 功能化合物促进hPSCs 向间充质样细胞分化常规方法中诱导hPSCs 分化为MSCs 的效率较低，可在培养基中添加营养物质以提高hPSCs 的自发分化效率。营养血清中含有促进细胞向中胚层和内胚层分化的物质，且容易获得，由此血清通常被添加至培养基中以促进细胞分化，最常用的为FBS［24］。此外，常使用血清替代物（knockout serum replacement，KSR）和白蛋白产品诱导分化细胞形成EBs［25］。但这些物质均含有动物源成分，存在微生物感染、免疫原性风险和选择杀伤作用低等问题，因此寻找可促使细胞向中内胚层分化的功能性化合物成为了研究热点。

LI 等［26］将重编程的鼠诱导PSCs （induced PSCs，iPSCs） 转移至超低黏附培养板形成EBs，于不含白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的ES 培养基中悬浮培养3 d 后转移至含维甲酸（retinoic acid，RA） 的ES 培养基培养2 d，后分别于含转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1、TGF-β3、bFGF 及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2的ES 培养基中培养3 d，均可诱导iPSCs 向间充质样细胞分化，且RA+TGF-β1 和RA+TGF-β3 可提高MSCs 的成骨分化效率，RA+BMP-2 可提高成软骨分化效率，表明TGF-β 家族的细胞因子对干细胞分化具有重要作用。LIAN 等［21］在培养基中加入EGF 和bFGF 富集MSCs，促进其生长增殖。此外，血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）也可能有利于促进干细胞向MSCs分化，提高细胞增殖能力［14］。BRUSCHI 等［27］发现：生长因子Wnt3a 和激活素A 在BMP4 的协同作用下， 培养4 d 即可获得大量hiPSCs-MSCs。ZHANG 等［28］发现： 联合使用 LLY-507 和AZD5153 可以使hESCs 或hiPSCs 高效地向MSCs转化，获得的hPSCs-MSCs 具有CD73 和CD105 高表达特征，并表现出多谱系分化潜能、良好的细胞活力、促血管生成和免疫调节特性。研究［27，29-30］显示：在hPSCs 的干性维持培养基中加入抑制剂可促进hPSCs 分化。CHEN 等［29］在含TGF 途径抑制剂SB431542 的hiPSC 培养基中培养hPSCs，10 d 后发现细胞的中胚层基因表达上调而多能性基因表达下调，并将分化的细胞常规转入MSCs 培养基中诱导分化。LIU 等［30］在hPSCs 培养基中加入ROCK抑制剂，后更换为MSCs 基础培养基，成功使3 种干细胞分化为MSCs。研究［27］将hPSCs 培养于含Y-27632 的干性维持培养基中，去除Y-27632 后成功获得了hPSCs 诱导生成MSCs 的中间产物EBs。

2 hPSCs-MSCs 的纯化和鉴定

hPSCs-MSCs 具有较强的自我更新能力，可在传代过程中被纯化［31］。目前最常用的纯化方法是将获得的细胞转入MSCs 培养基后连续传代5~7 次［32］。经4 次传代后，培养皿中的细胞便呈现均匀的长梭形［33］。此外，石伦刚等［34］将hESCs 悬浮培养10 d 后形成的拟胚体贴壁培养5~7 d，机械去除中心高密度部分细胞，保留周围剩余细胞连续传代， 提高了 hESCs-MSCs 的纯化效率。MOORE 等［35］通过细胞过滤器对产生的MSCs 进行纯化，细胞过滤器一般使用不同大小的微孔过滤细胞从而达到纯化的目的。细胞过滤的方法可以相对缩短分化周期，但目前尚无统一且高效的hPSCs-MSCs 纯化方法，使不同实验获得的细胞纯度难以保障［36］。

2006 年，国际细胞疗法学会间充质和组织干细胞委员会提出了鉴定hMSCs 的最低标准［37］。目前大部分hPSCs-MSCs 鉴定方法均参照此标准或改进此标准进行。但hPSCs-MSCs 作为一种特殊来源的MSCs， 需对其特性做出明确的界定。CHOUDHERY 等［38］在上述标准的基础上提出了鉴定hPSC-MSCs 的最低标准，主要包括：梭形的成纤维细胞样形态；标准培养条件下贴壁生长；阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90 和CD105 等表面标志物，且不表达CD45、CD34、CD14 或CD11b、 CD79a 或CD19 及人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR 等造血干细胞表面标记物； 不表达OCT4、 SOX2、 Klf4、Nanog、Lin28、TRA-1-60、TRA-1-81 和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP） 等iPSCs 诱导因子；可以在体外进行成脂、成骨及成软骨分化；不形成畸胎瘤；可以分泌MSC 相关旁分泌因子。除上述标准中所提出的表面标记物外，CD49、CD54、CD146、CD166 和HLA-ABC 也被认为是MSCs 的阳性表面标记物。与传统的MSCs 相似，即使是同一批次细胞，hPSC-MSCs 内部也存在表型和功能差异的亚细胞群。应明确与hPSC-MSCs质量和功能相关的标记物，生产高质量的hPSC-MSCs，以满足临床应用的需求。

3 hPSCs-MSCs 与成体MSCs 性能比较

与成体MSCs 比较，hPSCs-MSCs 具有来源广泛、质量可控制、可大量生产、低成本和高纯度等优点。但hPSCs-MSCs 的分化效率较低，EBs 法和单层法均为利用hPSCs 的自发分化获得间充质样细胞，仍未实现高效的定向诱导分化。目前大多使用基质胶、FBS、小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibrolast，MEF）和明胶等动物源性成分诱导分化，但其具有成分复杂、批次差异及病毒污染等问题，长期诱导可能引起细胞性状改变，与临床应用存在较大差距。目前hPSCs-MSCs 尚缺乏高效的细胞纯化方法，且无特异性标记物对获得的间充质样细胞进行鉴定，部分方法获得的间充质样细胞可能混杂残留的hPSCs，有产生畸胎瘤的风险，对其进行细致监测难度较大。因此，大规模和高效地获得高度纯化、均一、稳定和生物安全性好的间充质样细胞是亟待解决的关键问题。

4 hPSCs-MSCs 的应用前景

单纯的iPSCs/ESCs 理论上可无限增殖并具有良好的分化能力，能够满足大数量细胞需求，但细胞的自我更新和多能性也可能会导致肿瘤发生和体内移植后的不稳定性。将hPSCs 诱导为MSCs 样细胞可有利于后续定向分化，降低致瘤性，且细胞数量也可无限获得。目前，hPSCs-MSCs 的应用潜能已表现在多个方面。

与成体来源的MSCs 比较，hPSCs-MSCs 具有更强的增殖能力、较低的免疫原性和更好的免疫调节能力［19，30］。hPSCs-MSCs 的免疫调节作用已在动物实验中被广泛证实。研究［39］显示：hiPSCs-MSCs 与纳巴霉素联合作用可有效延长胰岛移植存活时间，甚至诱导50%的受体产生免疫耐受。二者协同作用可以抑制炎症细胞的渗透，并促进胰岛素持续释放。YU 等［40］发现：hiPSCs-MSCs 在心肺复苏中具有免疫调节作用，小鼠心肺复苏后注射定量hiPSCs-MSCs 可提高其生存率。研究［41］显示：hiPSCs-MSCs 能够影响巨噬细胞M1 表型和M2 表型之间的平衡，使可增加细胞损伤的M1 表型相关标记物水平降低和清除碎屑、促进血管化及组织重塑的M2 表型相关标记物水平升高，证实hiPSCs-MSCs 的免疫调节作用，并为缺血再灌注所造成脑损伤提供新的治疗思路。CHUNG 等［42］研究显示：由脂肪源性干细胞分化的iPSCs-MSCs仍保持MSCs 良好的分化能力，iPSCs-MSCs 与TGF-β 共同作用可治疗肌肉和骨骼损伤，TGF-β可下调组织相容性Ⅰ类复合物表达，降低免疫排斥反应。 QIN 等［43］发现： hESCs-MSCs 可降低B10.RⅢ小鼠严重实验性自身免疫性葡萄膜炎的发生。YANG 等［44］发现：将hiPSCs-MSCs 注射至腹膜内，可增加结肠长度并减小溃疡面积，且hiPSCs-MSCs 可通过肿瘤坏死因子诱导蛋白6（tumor necrosis factor-induced protein-6， TSG-6）上调肠上皮表面标记物CD44 的表达，促进黏膜愈合，证实hiPSCs-MSCs 的黏膜治疗作用。此外，MSCs 的旁分泌机制在血管化和肌肉再生中也可发挥作用［21］。

除调节免疫作用，hPSCs-MSCs 也可修复各类组织缺损。研究［45］显示：hiPSCs-MSCs 生长于磷酸钙支架上可促进成骨分化并引导骨再生。应用BMP-2 基因修饰hiPSCs-MSCs 的磷酸钙支架对骨矿化能力具有促进作用［46］。 通过移植hiPSCs-MSCs 可减轻小鼠后肢缺血和改善肝功能［47］。QI 等［48］构建hiPSCs-MSCs 释放谷胱甘肽过氧化物酶3 （glutathione peroxidase 3，GPx3），hiPSCs-MSCs-GPx3可有效抑制肝衰老，降低肝损伤。 JIANG 等［49］发现： 经玻璃体腔移植的hiPSCs-MSCs 可有效地将功能线粒体提供给视网膜神经节细胞，防止线粒体损伤所致的视网膜神经节细胞退变。GUO 等［50］发现：在心肌梗死小鼠模型中多次静脉注射hiPSCs-MSCs 可不同程度地恢复小鼠的心脏功能。YOON 等［51］研究显示：hESCs-MSCs 可恢复顺铂损伤后卵巢的结构和功能，通过向小鼠腹腔连续10 d 注射顺铂，建立卵巢早衰模型，静脉注射hESCs-MSCs 后发现其可有效保护雌鼠卵巢功能并保留生育能力，为hESCs-MSCs 治疗女性卵巢早衰的临床应用提供了新的思路。

5 总结与展望

综上所述，hPSCs 可通过EBs 法和单层法分化为间充质样细胞，hPSCs-MSCs 表现出与成体MSCs 相似的生物学特点与功能，还具有来源广泛、低成本和免疫原性更低等优点，进一步弥补了成体MSCs 的不足，具有重要的科研意义和临床应用价值。同时，hPSCs-MSCs 可促进血管化和组织重塑，用于修复各类组织缺损，并具有抗炎、免疫调节和免疫抑制能力等作用，使其成为再生医学和组织工程中应用最多的种子细胞。hPSCs-MSCs 能够在再生医学领域和组织工程领域展现出更大的优势与价值，具有巨大的科研价值和广阔的临床应用前景。