新型冠状病毒快速检测标本前处理方法改良及其效果评价

万广财, 李 铤, 孙唯秀, 于秀艳

（吉林省肿瘤医院检验科，吉林 长春 130012）

新型冠状病毒又称严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是β 属的单股正链RNA 病毒，直径为60~140 nm，病毒外观呈棘突样的球形［1-2］。SARS-CoV-2 具有传染性强、传播速度快和易突变等特点，在国内外流行性传播［3-4］。随着SARSCoV-2 的变异，其毒力减弱，但免疫逃逸能力增强。奥密克戎是SARS-CoV-2 的变异株，易感染人的支气管，但对肺部的损伤较轻。目前主要流行的变异株为奥密克戎XBB.1.5、 XBB.1.16 和 EG.5变异株。EG.5 变异株的F456L 和Q52H 基因发生突变，导致其对人体的呼吸道上皮细胞具有较强的亲和力。及时和高效地检出SARS-CoV-2 及其变异株对新型冠状病毒感染（corona virus disease 2019，COVID-19）的防治尤为重要。

《新型冠状病毒肺炎防控方案第十版》指南［5］将实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR） 法作为确诊SARS-CoV-2 阳性患者的金标准［6］。RT-qPCR 法具有灵敏度、特异性和精确性较高的特点，广泛应用于SARS-CoV-2 核酸检验［7］。目前多采用胍盐联合56 ℃、30 min 水浴的前处理方式以提高灭活效果，但其对SARS-CoV-2检测结果的影响尚未见报道。此外，SARS-CoV-2附着于呼吸道上皮细胞，传统的SARS-CoV-2 核酸检测方法通过单管震荡SARS-CoV-2 标本提高上皮细胞中SARS-CoV-2 检出率，该方法使用广泛，但较为耗时。本研究通过改良的SARS-CoV-2 前处理检测技术，提高SARS-CoV-2 核酸检测效率，为高效和快速地检测SARS-CoV-2 及相关冠状病毒提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2022 年3 月—2022 年9 月吉林省肿瘤医院SARS-CoV-2 阴性标本90 例和SARS-CoV-2 阳性标本30 例。纳入标准：①有RT-qPCR 检测结果；②有内参基因的扩增曲线。排除标准：① 无RT-qPCR 检测结果；② 无内标基因的扩增曲线。研究符合《赫尔辛基宣言》原则。

1.2 主要试剂和仪器核酸提取试剂（批号：20210802A） 和SARS-CoV-2 核酸扩增试剂（批号：20210802A）（上海伯杰医疗科技有限公司），郑州标源质控品（批号：20210216，浓度为316~3 160 copies·mL－1），含胍盐的病毒采样管（批号：20210168，北京热景生物技术股份有限公司）。全自动核酸提取仪（BG-Abot-96，上海伯杰医疗科技有限公司）， RT-qPCR 仪（ABI7500， 美国Thermofisher 公司），数显三用恒温水箱（LH-600，上海皓庄仪器有限公司）。

1.3 研究对象分组分别用传统方法和2 种改良方法检测90 例SARS-CoV-2 阴性标本及30 例SARS-CoV-2 阳性标本，按照检测方法分为传统组、改良1 组和改良2 组。传统组采用胍盐联合56 ℃、30 min 水浴方式灭活、单管震荡、标本去编号和单手开盖方式检测；改良1 组采用胍盐灭活、单管震荡、标本去编号和单手开盖方式检测；改良2 组采用胍盐灭活，上下、左右和180 度角的方式整批震荡，标本去编号及单手开盖方式检测。见图1。

图1 改良2 组上下、左右和180 度角的震荡方式示意图Fig. 1 Schematic diagram of oscillation ways of vertical,horizontal, and at a 180-degree angle in modified 2 group

1.4 核酸提取各组分别加入200 μL 待测标本、3 个阴性对照、1 个阳性对照和1 个质控品（郑州标源生物科技有限公司）。采用上海伯杰全自动核酸提取仪及其配套提取试剂进行核酸提取。

1.5 RT-qPCR 法检测各组标本采用RT-qPCR法检测各组标本中SARS-CoV-2 内参基因、N 基因和ORF1ab 基因。反应体系：12 μL 核酸扩增反应液、4 μL 酶混合液和4 μL ORF1ab/N 反应液。反应条件：50 ℃、10 min 逆转录，95 ℃、5 min 预变性，95 ℃、10 s，55 ℃、40 s，共45 个循环。每次实验使用同一批号试剂平行测量3 次，取平均循环阈值（cycling threshold，Ct） 值，记录各组标本SARS-CoV-2 检出时间。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行统计学分析并绘图。采用Spearman 相关分析法分析2 组间Ct 值的相关性，相关系数（r）越接近1，相关性越强。采用Bland-Altman 法对2 组间Ct 值进行一致性检验［5］。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组SARS-CoV-2 相关性分析改良1 组Ct 值（29.87±1.68） 与传统组Ct 值（29.92±1.65） 具有强相关性（P<0.01），线性回归方程为Y=0.992 7X+0.175 6，r=0.975 4（0.966 2—0.982 1）。改良2 组（29.90±1.63） 与传统组（29.92±1.65）的Ct 值具有强相关性（P<0.01），线性回归方程为Y=0.975 9X+0.704 6，r=0.986 2（0.980 9—0.990 0）。见图2~4。

图2 改良1 组和传统组目的基因扩增曲线Fig. 2 Amplification curves of target genes in modified 1 group and traditional group

图3 改良2 组和传统组目的基因扩增曲线Fig. 3 Amplification curves of target genes in modified 2 group and traditional group

图4 各组SARS-CoV-2 相关性分析Fig. 4 Correlation analysis on SARS-CoV-2 between various groups

2.2 各组SARS-CoV-2 一致性检验改良1 组与传统组检测SARS-CoV-2 阴性标本的组间偏差为0.158 2（－0.613 7—0.930 1），检测SARS-CoV-2阳性标本的组间偏差为0.117 0 （－0.403 1—0.637 1），2 组间Ct 值偏差均小于1，证实改良1 组与传统组呈良好的一致性。改良2 组与传统组检测SARS-CoV-2 阴性标本的组间偏差为0.015 7（－0.550 4—0.581 8），检测SARS-CoV-2 阳性标本的组间偏差为0.022 7（－0.454 1—0.499 4），2 组间Ct 值偏差均小于1，证实改良2 组与传统组呈良好的一致性。见图5。

图5 各组SARS-CoV-2 一致性检验Fig. 5 Consistency test for SARS-CoV-2 in various groups

2.3 各组SARS-CoV-2 检出时间改良1 组检测90 例SARS-CoV-2标本检出时间为15 min，改良2 组检测90 例SARS-CoV-2 标本检出时间为10 min，传统组检测90 例SARS-CoV-2 标本检出时间为45 min。与传统组比较，改良组1 检出时间可减少约67%，改良2 组检出时间可减少约11%。

3 讨 论

SARS-CoV-2 具有极强的传染力，人群普遍易感；其主要通过与肺泡上皮细胞表达的血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）结合而侵入人体［8-9］。ACE2 可参与SARS-CoV-2全部生命周期活动［10］。SARS-CoV-2 侵入人体后，疾病进展迅速，主要表现为呼吸困难、嗅觉和味觉消失。研究［11-12］表明：奥密克戎变异株的K417N、E484A、N501Y、F456L 和Q52H 基因及Delta 变异株的刺突蛋白发生变异，使SARS-CoV-2 致病力减弱，免疫逃逸能力增强。因此需要一种快速和高效的核酸检验方法检出SARS-CoV-2。

本研究结果显示：通过将胍盐联合56 ℃、30 min 水浴方式灭活改良为胍盐灭活，可减少约66%的SARS-CoV-2 检出时间，2 种灭活方式的Ct值具有强相关性和良好的一致性，提示胍盐灭活可替代传统灭活方式。将单管震荡改良为上下、左右和180 度角整批震荡，检出时间可减少约11%，2 种震荡方式的Ct 值具有强相关性和良好的一致性，提示上下、左右和180 度整批震荡可替代单管震荡。改良震荡方式的检出时间更短，为更理想的SARS-CoV-2 检测方法。

SARS-CoV-2 对热和紫外线敏感，陈培松等［1］研究表明：56 ℃、30min 灭活方式对SARS-CoV-2核酸检测无明显影响。胍盐具有溶解和变性蛋白质的作用，可使核蛋白的二级结构消失。同时胍盐可灭活核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），保护SARS-CoV-2 核酸结构完整性［13-14］。研究［15-20］显示：胍盐和56 ℃、30 min 水浴方式均可有效灭活病毒， 保证SARS-CoV-2 核酸含量基本不变，与本研究结果一致。在采用胍盐灭活的前提条件下，56 ℃、30 min 水浴对上皮细胞中SARS-CoV-2 核酸含量改变无明显影响，因此在有胍盐灭活的前提条件下，不推荐56℃、30 min 水浴的灭活方式。

本研究采用的改良SARS-CoV-2 标本检测方法与传统检测方法具有强相关性和良好一致性，可节约核酸检出时间，提升SARS-CoV-2 核酸检测效率，可为高效和快速地检测SARS-CoV-2 及相关冠状病毒提供参考。