乌蕨活性成分含量测定方法

陈 明，段 萍

(1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013；2.黔南州检验检测院食品药品检验所，贵州 都匀 558000)

乌蕨Stenolomachusanum(L.)Ching为鳞始蕨科乌蕨属多年生草本植物，别名乌韭、大叶金花草等[1-2]。从上世纪90年代至今，国内学者对乌蕨的活性成分及含量测定方法进行了大量研究，已经发现的活性成分主要为黄酮类及酚酸类，包括荭草苷、荭草苷-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荆素、芹菜素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素吡喃葡萄糖苷、丁香酸、原儿茶酸、原儿茶醛、香草酸、2，5-二羟基苯甲酸甲酯 、邻苯二甲酸-二(2-乙基-己基)酯、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸、4-O-β-D- (6-O-gentisoylglucopyranosy1)vanillic acid、2-O-β-D- (6-O-gentisoylglucopyranosy1)gentisicacid及6，7-二羟基香豆素等[3-4]。对活性成分含量测定方法的研究文献也比较丰富。笔者认为乌蕨活性成分含量测定的方法取得了显著的进步，基本可满足制定乌蕨质量标准的有关需要，现综述如下。

1 乌蕨中酚酸类成分的含量测定方法

酚酸类是乌蕨的主要活性成分，含量较高的是原儿茶酸及原儿茶醛。对酚酸类的含量测定传统上采用可见分光光度法，目前大多研究者采用高效液相色谱法。

1.1 可见光分光光度法 龚晓莉等[5]研究认为，乌蕨总酚酸的提取采用水和75%乙醇为溶剂，在57℃超声30 min效果最佳。总酚酸的测定方法为：以原儿茶酸为对照品，配制对照品溶液；以0.3%十二烷基硫酸钠及6%FeCl3～0.9%K3[Fe(CN)](1∶0.9)混合溶液为显色剂，混匀，在暗处放置5 min，加0.1 mol/L HC1至刻度，混匀，在暗处放置30 min。以试剂为空白，在717 nm波长处测定吸光度，以浓度C(g/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。原儿茶酸含量在0.440～3.083 g/ml范围内呈现良好的线性关系。该方法测定的含量为乌蕨总酚酸含量。

1.2 高效液相色谱法 随着高效液相色谱仪等精密仪器在基层的逐步普及，陈明等[6]采用HPLC法对乌蕨中酚酸类成分含量测定方法进行了有关研究，色谱条件为：色谱柱迪马Diamonsil ODS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm )、Agilent ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.4%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～20 min，98%～92% A；20～35 min，92%～98% A；35～40 min，98%A；流速：1.0 ml/min；进样量：5 μl；柱温：30℃；检测波长：280 nm。理论板数以原儿茶醛峰计算不低于3 000。原儿茶酸在0.161 8～1.213 0 μg/ml内呈良好的线性关系；原儿茶醛在0.060 3～0.452 2 μg/ml内呈良好的线性关系。该方法同时测定了乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛的含量，与可见分光光度法相比，结果更为准确、精密度高，重复性、稳定性好。

2 乌蕨中黄酮类成分的含量测定方法

乌蕨中另一类主要活性成分是黄酮类，主要包括：荭草苷、荭草苷-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荆素、芹菜素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素吡喃葡萄糖苷等。其药理活性广泛，有抗炎、抗菌、抗氧化、解毒、降血糖等作用。在上世纪70～90年代的药品质量标准中，主要采用分光光度法测定总黄酮含量，目前则逐步转向采用更精密的高效液相色谱法。

2.1 可见分光光度法 主要对乌蕨的总黄酮进行测定，为黄酮类成分含量传统测定方法。基本方法为[7-8]：以芦丁为对照品配置不同浓度的标准溶液，于波长 510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线并计算出回归方程；样品在相同条件下测定吸光度，与标准曲线对比即得相应的总黄酮含量。

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 高效液相色谱法测定乌蕨中牡荆苷的含量 凌宏斌等[9]采用HPLC法对乌蕨中黄酮类活性成分牡荆苷(牡荆素)的含量进行测定。色谱条件采用Dionex-Cl8(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；乙腈-0.2%冰醋酸水溶液(23∶77)为流动相；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：10 μl；检测波长270 nm。在此色谱条件下，牡荆苷峰理论板数不小于3 000，分离度大于1.5。结果表明牡荆苷在0.009～0.180 mg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.2.2 HPLC-DAD双波长法同时测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷的含量 为更为高效便捷地测定黄酮类活性成分的含量，胡燕珍等[10]采用HPLC-DAD双波长法同时测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷的含量。色谱条件为：色谱柱Dikmatech Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱；检测波长：260 nm(原儿茶酸、原儿茶醛)、340 nm(牡荆苷)；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃ ；进样量：10 μl。原儿茶酸线性范围0.050 3～0.502 6 μg；原儿茶醛线性范围0.056 4～0.564 0 μg；牡荆苷线性范围0.143 0～1.430 4 μg。

2.2.3 双波长高效液相色谱法同时测定乌蕨6种主要活性成分含量 乌蕨的主要活性成分包括酚酸类、黄酮类，为实现便捷高效地同时测定乌蕨的多种活性成分，陈明等[11]通过长期反复摸索，提出了采用双波长高效液相色谱法同时测定乌蕨6种主要活性成分含量的方法，可以实现同时测定黄酮类、酚酸类主要活性成分。色谱条件为：赛默飞A型C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0～5 min(8%A)，5～15 min(8%A～10%A)，15～30 min(10%A～27%A)，30～31 min(27%A～8%A)，31～40 min(8%A)，原儿茶酸、原儿茶醛检测波长为280 nm，荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、木犀草苷检测波长为350 nm，柱温30℃，流速1.0 ml/min，进样量5 μl。原儿茶酸线性范围0.161 9～1.214 4 μg；原儿茶醛线性范围0.063 7～0.477 9 μg；荭草苷线性范围0.083 5～0.626 5 μg；牡荆素鼠李糖苷线性范围0.238 5～1.788 5 μg；牡荆素线性范围0.077 8～0.583 7 μg；木犀草苷线性范围0.026 3～0.197 0 μg。

2.2.4 一测多评法测定乌蕨中5个黄酮成分含量 在总结有关含量测定方法研究成果的基础上，万红才等[12]采用一测多评法对乌蕨中5个黄酮类成分进行含量测定。色谱条件为：安捷伦C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以5%四氢呋喃乙腈溶液(A)-0.4%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～20 min，15%A；20～35 min，15%A→18%A；35～40 min，18%A→35%A；40～41 min，35% A→15%A；41～50 min，15%A)，流速1.0 ml/min ，检测波长360 nm，柱温30℃，进样量10 μl。线性范围：荭草苷0.098 4～0.983 5 μg、牡荆素葡萄糖苷0.081 8～0.817 8 μg、牡荆素鼠李糖苷0.094 2～0.941 6 μg、牡荆素0.099 5～0.995 4 μg、木犀草苷0.080 3～0.803 4 μg。待测组分相对校因正子测定及计算：以牡荆素为内参物，计算待测成分荭草苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、木犀草苷的相对校正因子，按照相对校正因子计算公式：fx/r = (Cr ×Ax)/ (Cx×Ar)，式中Cr为参照物浓度，Ar为参照物峰面积，Cx为待测组分浓度，Ax为待测组分峰面积，分别计算荭草苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、木犀草苷的校正因子分别为0.772、1.368、1.380、0.731，RSD分别为1.2%、0.47%、0.97%、0.60%。相对校正因子耐用性考察：按上述色谱条件，分别用仪器(安捷伦、赛默飞、岛津)和色谱柱(安捷伦、赛默飞、欧姆尼)对相对校正因子和相对保留时间进行考察，结果相对校正因子的RSD在1.5%～0.35%之间，相对保留时间(待测成分峰保留时间T与内参物峰保留时间TR，Tx=T/TR)的RSD在1.3%～0.50%之间，说明相对校正因子和相对保留时间不同仪器和色谱柱条件下的耐用性良好。

3 小结

乌蕨作为一种在我国广泛分布的常见天然药物，在少数民族地区被长期使用并多次收录进入地方标准，在传统医学中有较高地位。为保证药物的质量，对其有效成分进行科学检测具有重要意义。乌蕨活性成分的含量测定方法比较多，如紫外-可见分光光度法操作简便、经济实用、仪器普及率高，易于在基层单位推广使用，适用于植物中总黄酮、总酚酸含量的粗略测定；缺点是不能准确检测每一种活性成分的含量，不能够检测出含量较低的活性成分，精密度不高、专属性不强。HPLC法可将各活性成分进行分离测定，精密度高、专属性强，能够实现微量测定，目前应用较广。同时，随着技术手段的不断进步，测定精度增高、测定时间缩短、操作程序进一步简化，节约资源、减少污染是测定方法发展的必然趋势[13]。就目前科研单位及生产企业的设备条件而言，高效液相色谱法已经能够基本满足乌蕨质量控制的需要，可以推广使用。