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正交优化超声辅助法提取土党参中党参炔苷的工艺研究

2024-01-11陆廷祥韩忠耀徐英志刘明涛刘承贵黄华军

黔南民族医专学报 2023年4期
关键词:党参甲醇溶液

陆廷祥,韩忠耀,徐英志,刘明涛,刘承贵,黄华军

(黔南民族医学高等专科学校,贵州 都匀 558013)

土党参为桔梗科金钱豹属植物金钱豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的干燥根,主产于我国贵州、四川、湖北、湖南等地[1]。土党参作为药食同源植物,目前已列入贵州省苗族等少数民族药材目录,收录于《贵州省中药材及民族药材质量标准》(2003年版)[2]。土党参以野生为主,资源蕴藏量低[3],其性平味甘,归脾、肺经,有补中益气,润肺生津,止血,通乳之功效,常用于治疗虚劳内伤,脾虚泄泻,肺虚咳嗽,乳汁不多,小儿疳积,小儿遗尿[4]。由于土党参功效显著,现已被开发为多种制剂及列入保健品专利[5-7]。

土党参中主要化学成分为党参炔苷、多糖、甾体、三萜、黄酮、蛋白质等多种物质[8-10],药理研究表明党参炔苷有促进溃疡愈合,修复胃黏膜损伤[11]的作用,与其补中益气的功效相符,土党参多糖具有保护脑损伤、提高学习记忆力、抗疲劳、抗缺氧、抗脑缺血[12-15]等生物活性。

目前,对土党参中活性物质党参炔苷的提取工艺未见报道,对其开展深入研究,有助于更好的开发利用土党参资源。由于党参炔苷属于聚乙炔类化合物,含共轭三键,具有不饱和性,易发生加成、氧化等反应,故提取工艺对党参炔苷的提取有重要的影响。超声波辅助提取技术是近年来中药材提取常用的一种新技术,具有提取率高、提取速度快的优点。因超声波可在液体中有效的搅动与流动,使样品破碎,减小颗粒大小,扩大样品与溶剂的接触面积,从而提高传质速率,使被测组分快速转入溶剂中,促进样品中有效成分与提取溶剂充分混合,达到快速提取[16-17]。本文应用超声波辅助技术对土党参中的党参炔苷进行提取,以党参炔苷的含量为考量指标,分别进行单因素和正交试验,从而对土党参中党参炔苷的提取工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 土党参采集于贵州省都匀市匀东镇,经黔南民族医学高等专科学校王传明副教授鉴定为金钱豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的根;党参炔苷对照品(批号:CHB180122,纯度:≥98%):成都克洛玛生物科技有限公司;乙腈为色谱纯;甲醇为分析纯;水为娃哈哈纯净水。

Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD检测器,四元梯度泵、自动进样器、柱温箱,美国安捷伦科技公司);AS10200A型超声仪(杭州汇尔公司);DV215CD电子分析天平(d=0.000 01 g,美国OHAΜS公司);AE240电子分析天平(d=0.000 1 g 瑞士METTLERTOLEDO公司);电热鼓风干燥箱101-3AB型(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsiL C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)(18∶82);检测波长为268 nm;流速:1 ml·min-1;柱温:30℃。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取党参炔苷对照品,置于25 ml棕色容量瓶中,加入甲醇溶解并定容,摇匀,即得浓度为0.252 0 mg·ml-1的对照品储备溶液。

1.2.3 样品预处理 土党参净选后,切制成厚片,置于电热干燥烘箱中60℃烘烤8 h;干燥后,用粉碎机磨细,过60目标准分样筛备用。

1.2.4 土党参供试品溶液的制备 精密称取“1.2.3”项样品1 g,置于具塞锥形瓶中,加入设定浓度和体积的溶剂,按照设定的温度、时间进行超声提取;将提取液放置于离心机中,以转速为4 000 r/min离心5 min ,收集上清液,再加入同等浓度的甲醇定容至100 ml,摇匀,过0.45 μm滤膜,取续滤液得到供试品溶液。

1.2.5 党参炔苷含量的测定 (1)系统适应性实验。分别取对照品溶液和供试品溶液10 μl,按“1.2.1”项色谱条件进样,记录色谱图,结果见图1,结果表明,在此条件下,党参炔苷分离度大于1.5,具有良好的分离效果。(2)线性关系考察。标准曲线的制作:别取0.252mg·ml-1党参炔苷对照品溶液 0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 ml,置于10 ml棕色容量瓶,用甲醇稀释至刻度。按“1.2.1”色谱条件进行测定,以党参炔苷质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程y=1 404x-16.24,R2=0.999 9,表明党参炔苷质量浓度在0.012 6~0.201 6 mg·ml-1范围内,有良好的线性关系。精密度实验、稳定性实验和重复性实验的方法及结果见参考文献[18],结果表明所用仪器精密度良好,供试品溶液中的党参炔苷在24 h内稳定性,该实验方法重复性良好。加标回收率:取同一批次土党参样品,按“1.2.4”中方法制备6份样品溶液,分别精密加入1.8 mg党参炔苷标准品,制成加标回收率供试品溶液,测定并计算样品中党参炔苷的回收率,结果见参考文献[18],结果表明该样品中党参炔苷平均加标回收率为98.8%,RSD为1.02%(n=6),符合要求。(3)党参炔苷含量的测定。移取供试品溶液,按照“1.2.1”项色谱条件进行测定,根据公式计算不同实验中土党参中党参炔苷的含量。党参炔苷的含量(mg·g-1)=CV/M式中:C为提取液中党参炔苷的浓度(mg·ml-1);V为提取液的最终体积(ml);M为土党参样品的质量(g)。

图1 党参炔苷对照品(a)和供试品(b)溶液的HPLC色谱图

1.2.6 单因素实验考察 (1)甲醇浓度的影响 设定超声温度40℃,料液比1∶40 (g·ml-1),提取时间40 min。甲醇浓度分别取50%、60%、70%、80%、90%进行提取实验,研究甲醇浓度与党参炔苷含量的变化趋势。(2)料液比的影响 设定超声提取温度40℃,甲醇浓度60%,提取时间40 min。料液比分别取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g·ml-1)进行提取实验,研究料液比与党参炔苷含量的变化趋势。(3)提取温度的影响 设定甲醇浓度60%,料液比1∶40 (g·ml-1)、提取时间40 min。提取温度分别取10、20、40、60、80℃进行提取实验,研究提取温度与党参炔苷含量的变化趋势。(4)提取时间的影响 设定甲醇浓度60%,料液比1∶40 (g·ml-1)、提取温度40℃。提取时间分别取10、20、30、40、50 min进行提取实验,研究提取时间与党参炔苷含量的变化趋势。

1.2.7 土党参党参炔苷超声波辅助提取工艺优化 根据单因素试验考察结果,确定各单因素的最优工艺水平,选择甲醇浓度、料液比、提取温度、提取时间作为考察因素,以土党参党参炔苷含量为考察指标,采用正交试验L9(34)选取的最佳工艺条件。设计的因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 正交实验结果及分析 正交实验安排及结果见表2,方差分析见表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

通过表3中试验数据中K值和R值的大小分析可知,当组合为A1B2C3D2时,党参炔苷含量最大,由R值大小可知,影响党参炔苷提取含量大小的因素主次顺序B>C>D>A,即料液比影响较大,温度次之,甲醇浓度较小,超声时间影响最小,最优组合A1B2C3D2。综合各因素作用,最终选定土党参中党参炔苷的最优提取工艺为:甲醇浓度60%,料液比1∶40 (g·ml-1),提取温度60℃,提取时间40 min。由方差分析表3中试验数据可以看出,料液比、温度达到显著 (P<0.05)水平,表明料液比、温度两个因素均显著地影响土党参中党参炔苷的含量。其他两个因素无显著性影响。

2.2 验证试验 用试验结果中提取最优的工艺条件:甲醇浓度60%,料液比1∶40 (g·ml-1),提取温度60℃,提取时间40 min,同时制备6份平行试样,测定党参炔苷的含量,其平均含量为 2.989 mg·g-1,均高于正交实验设计中的9组实验结果的党参炔苷含量。结果见表4。

表4 验证性实验结果

3 讨论

党参炔苷作为土党参的质量评价重要指标,有关文献[20]报道使用甲醇溶剂提取党参炔苷效果较好,采用甲醇溶剂对土党参中党参炔苷进行含量测定[21],但由于党参炔苷对温度较为敏感,高温会影响其稳定性[22]。本实验为了优化土党参中党参炔苷的提取工艺,以党参炔苷含量作为评价指标,根据单因素试验和正交实验结果,得到最优工艺为甲醇浓度60%,料液比1∶40 (g·ml-1),提取温度60℃,提取时间40 min,此条件下,党参炔苷含量高达2.989 mg·g-1。通过方差分析,料液比和温度两因素为显著因素,这是因为党参炔苷的结构式中有易发生氧化还原反应的炔键,所以分子极性偏大。在提取工艺设计过程中,特设定温度因素,是为了验证温度的影响,同时有利于找出较合适的提取温度。

前期实验组分别采用回流提取法、超声提取法及微波提取法进行对比研究,前两种提取方法较好,且含量相差微小。故采用超声提取法,它消耗时间短,适应性广,且成本低,易于操作,节约资源的优势,为土党参中党参炔苷的提取工艺提供了参考,为有效地控制土党参质量提供依据。

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