正交优化超声辅助法提取土党参中党参炔苷的工艺研究

陆廷祥，韩忠耀，徐英志，刘明涛，刘承贵，黄华军

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013)

土党参为桔梗科金钱豹属植物金钱豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的干燥根，主产于我国贵州、四川、湖北、湖南等地[1]。土党参作为药食同源植物，目前已列入贵州省苗族等少数民族药材目录，收录于《贵州省中药材及民族药材质量标准》(2003年版)[2]。土党参以野生为主，资源蕴藏量低[3]，其性平味甘，归脾、肺经，有补中益气，润肺生津，止血，通乳之功效，常用于治疗虚劳内伤，脾虚泄泻，肺虚咳嗽，乳汁不多，小儿疳积，小儿遗尿[4]。由于土党参功效显著，现已被开发为多种制剂及列入保健品专利[5-7]。

土党参中主要化学成分为党参炔苷、多糖、甾体、三萜、黄酮、蛋白质等多种物质[8-10]，药理研究表明党参炔苷有促进溃疡愈合，修复胃黏膜损伤[11]的作用，与其补中益气的功效相符，土党参多糖具有保护脑损伤、提高学习记忆力、抗疲劳、抗缺氧、抗脑缺血[12-15]等生物活性。

目前，对土党参中活性物质党参炔苷的提取工艺未见报道，对其开展深入研究，有助于更好的开发利用土党参资源。由于党参炔苷属于聚乙炔类化合物，含共轭三键，具有不饱和性，易发生加成、氧化等反应，故提取工艺对党参炔苷的提取有重要的影响。超声波辅助提取技术是近年来中药材提取常用的一种新技术，具有提取率高、提取速度快的优点。因超声波可在液体中有效的搅动与流动，使样品破碎，减小颗粒大小，扩大样品与溶剂的接触面积，从而提高传质速率，使被测组分快速转入溶剂中，促进样品中有效成分与提取溶剂充分混合，达到快速提取[16-17]。本文应用超声波辅助技术对土党参中的党参炔苷进行提取，以党参炔苷的含量为考量指标，分别进行单因素和正交试验，从而对土党参中党参炔苷的提取工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 土党参采集于贵州省都匀市匀东镇，经黔南民族医学高等专科学校王传明副教授鉴定为金钱豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的根；党参炔苷对照品(批号：CHB180122，纯度：≥98%)：成都克洛玛生物科技有限公司；乙腈为色谱纯；甲醇为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD检测器，四元梯度泵、自动进样器、柱温箱，美国安捷伦科技公司)；AS10200A型超声仪(杭州汇尔公司)；DV215CD电子分析天平(d=0.000 01 g，美国OHAΜS公司)；AE240电子分析天平(d=0.000 1 g 瑞士METTLERTOLEDO公司)；电热鼓风干燥箱101-3AB型(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsiL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)(18∶82)；检测波长为268 nm；流速：1 ml·min-1；柱温：30℃。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取党参炔苷对照品，置于25 ml棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为0.252 0 mg·ml-1的对照品储备溶液。

1.2.3 样品预处理 土党参净选后，切制成厚片，置于电热干燥烘箱中60℃烘烤8 h；干燥后，用粉碎机磨细，过60目标准分样筛备用。

1.2.4 土党参供试品溶液的制备 精密称取“1.2.3”项样品1 g，置于具塞锥形瓶中，加入设定浓度和体积的溶剂，按照设定的温度、时间进行超声提取；将提取液放置于离心机中，以转速为4 000 r/min离心5 min ，收集上清液，再加入同等浓度的甲醇定容至100 ml，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液得到供试品溶液。

1.2.5 党参炔苷含量的测定 (1)系统适应性实验。分别取对照品溶液和供试品溶液10 μl，按“1.2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，结果见图1，结果表明，在此条件下，党参炔苷分离度大于1.5，具有良好的分离效果。(2)线性关系考察。标准曲线的制作：别取0.252mg·ml-1党参炔苷对照品溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 ml，置于10 ml棕色容量瓶，用甲醇稀释至刻度。按“1.2.1”色谱条件进行测定，以党参炔苷质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程y=1 404x-16.24，R2=0.999 9，表明党参炔苷质量浓度在0.012 6～0.201 6 mg·ml-1范围内，有良好的线性关系。精密度实验、稳定性实验和重复性实验的方法及结果见参考文献[18]，结果表明所用仪器精密度良好，供试品溶液中的党参炔苷在24 h内稳定性，该实验方法重复性良好。加标回收率：取同一批次土党参样品，按“1.2.4”中方法制备6份样品溶液，分别精密加入1.8 mg党参炔苷标准品，制成加标回收率供试品溶液，测定并计算样品中党参炔苷的回收率，结果见参考文献[18]，结果表明该样品中党参炔苷平均加标回收率为98.8%，RSD为1.02%(n=6)，符合要求。(3)党参炔苷含量的测定。移取供试品溶液，按照“1.2.1”项色谱条件进行测定，根据公式计算不同实验中土党参中党参炔苷的含量。党参炔苷的含量(mg·g-1)=CV/M式中：C为提取液中党参炔苷的浓度(mg·ml-1)；V为提取液的最终体积(ml)；M为土党参样品的质量(g)。

图1 党参炔苷对照品(a)和供试品(b)溶液的HPLC色谱图

1.2.6 单因素实验考察 (1)甲醇浓度的影响 设定超声温度40℃，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取时间40 min。甲醇浓度分别取50%、60%、70%、80%、90%进行提取实验，研究甲醇浓度与党参炔苷含量的变化趋势。(2)料液比的影响 设定超声提取温度40℃，甲醇浓度60%，提取时间40 min。料液比分别取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g·ml-1)进行提取实验，研究料液比与党参炔苷含量的变化趋势。(3)提取温度的影响 设定甲醇浓度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)、提取时间40 min。提取温度分别取10、20、40、60、80℃进行提取实验，研究提取温度与党参炔苷含量的变化趋势。(4)提取时间的影响 设定甲醇浓度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)、提取温度40℃。提取时间分别取10、20、30、40、50 min进行提取实验，研究提取时间与党参炔苷含量的变化趋势。

1.2.7 土党参党参炔苷超声波辅助提取工艺优化 根据单因素试验考察结果，确定各单因素的最优工艺水平，选择甲醇浓度、料液比、提取温度、提取时间作为考察因素，以土党参党参炔苷含量为考察指标，采用正交试验L9(34)选取的最佳工艺条件。设计的因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 正交实验结果及分析 正交实验安排及结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

通过表3中试验数据中K值和R值的大小分析可知，当组合为A1B2C3D2时，党参炔苷含量最大，由R值大小可知，影响党参炔苷提取含量大小的因素主次顺序B>C>D>A，即料液比影响较大，温度次之，甲醇浓度较小，超声时间影响最小，最优组合A1B2C3D2。综合各因素作用，最终选定土党参中党参炔苷的最优提取工艺为：甲醇浓度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取温度60℃，提取时间40 min。由方差分析表3中试验数据可以看出，料液比、温度达到显著 (P<0.05)水平，表明料液比、温度两个因素均显著地影响土党参中党参炔苷的含量。其他两个因素无显著性影响。

2.2 验证试验 用试验结果中提取最优的工艺条件：甲醇浓度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取温度60℃，提取时间40 min，同时制备6份平行试样，测定党参炔苷的含量，其平均含量为 2.989 mg·g-1，均高于正交实验设计中的9组实验结果的党参炔苷含量。结果见表4。

表4 验证性实验结果

3 讨论

党参炔苷作为土党参的质量评价重要指标，有关文献[20]报道使用甲醇溶剂提取党参炔苷效果较好，采用甲醇溶剂对土党参中党参炔苷进行含量测定[21]，但由于党参炔苷对温度较为敏感，高温会影响其稳定性[22]。本实验为了优化土党参中党参炔苷的提取工艺，以党参炔苷含量作为评价指标，根据单因素试验和正交实验结果，得到最优工艺为甲醇浓度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取温度60℃，提取时间40 min，此条件下，党参炔苷含量高达2.989 mg·g-1。通过方差分析，料液比和温度两因素为显著因素，这是因为党参炔苷的结构式中有易发生氧化还原反应的炔键，所以分子极性偏大。在提取工艺设计过程中，特设定温度因素，是为了验证温度的影响，同时有利于找出较合适的提取温度。

前期实验组分别采用回流提取法、超声提取法及微波提取法进行对比研究，前两种提取方法较好，且含量相差微小。故采用超声提取法，它消耗时间短，适应性广，且成本低，易于操作，节约资源的优势，为土党参中党参炔苷的提取工艺提供了参考，为有效地控制土党参质量提供依据。