基于BMP2/Smad4信号通路探究蛇床子素对骨质疏松性骨折大鼠愈合过程的影响

黄鑫 吴永光 王炯

(华中科技大学协和江北医院骨科,湖北 武汉 430100)

骨质疏松性骨折(OPF)由骨质疏松(OP)症患者骨微结构退化和骨量减少所引起OP并发症,常发生于老年人群〔1〕。尽管临床中通过使用雌激素替代疗法来降低OPF的发生风险,但雌激素的长期使用会导致多种妇科疾病的发生,因此迫切需要寻找新型替代药物〔2〕。蛇床子素是一种从蛇床子中提取的具有药理作用的活性成分,已有多项研究表明其可刺激骨形成及成骨细胞分化,有效改善OP〔3〕,除此之外,其在股骨横向骨折小鼠的骨折修复中具有明显的促进作用〔4〕。骨形态发生蛋白(BMP)2/Smad4信号通路在骨相关疾病中具有广泛的研究,激活该通路可促进老年OPF骨折愈合能力〔1〕。有报道称,蛇床子素可通过激活BMP2/Smad信号通路促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化〔5〕,但关于蛇床子素调控BMP2/Smad4信号通路改善OPF的相关体内研究报道还未发现。本研究基于BMP2/Smad4信号通路探究蛇床子素对OPF大鼠愈合过程的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 将90只从济南朋悦实验动物繁育有限公司购买的雌性SD大鼠(体质量270～310 g,SPF级)饲养于湿度及温度适宜、12 h/12 h昼夜周期的环境,许可证:SCXK(鲁)2019 0003。

1.2试剂和仪器 蛇床子素(CFN98765,武汉中标科技有限公司);兔抗Runt相关转录因子(RUNX)2、Smad4、β-actin抗体(12556、38454、4970,Cell Signaling Technology);兔抗BMP2抗体(18933-1-AP,Proteintech);兔抗成骨细胞特异性转录因子(Osterix)抗体、Goat Anti-Rabbit IgG H&L辣根过氧化物酶(HRP,ab209484、ab6721,Abcam);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(G1120-100,北京祥生兴业科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(WLA004a,沈阳万类生物科技有限公司);抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)ELISA试剂盒(E02T0537,上海蓝基生物科技有限公司);碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(LCS36163,厦门仑昌硕生物科技有限公司);shRNA及shRNA-BMP2重组慢病毒由上海基因医药合成;Dexa Pro-I双能X线骨密度仪、LCT200 Micro-CT仪、EnVision®多功能酶标仪〔汇佳生物股份(中国)有限公司〕。

1.3分组与OPF大鼠模型建立 随机选取15只大鼠作假手术(Sham)组,其余大鼠进行OPF模型建立:腹腔注射30 mg/kg 戊巴比妥钠(3%)将大鼠麻醉后从腰背侧开口切除双侧卵巢以建立OP大鼠模型,Sham组切除卵巢旁等体积的脂肪组织,术后连续3 d肌肉注射80×104U青霉素以防止感染,6 w后通过X射线测定大鼠BMD,BMD于造模前相比显著低则建立成功,在OP造模成功后麻醉全部大鼠,于右侧大腿外侧开口以暴露股骨,线锯横向将股骨锯断后使用克氏针固定断端,缝合切口后注射青霉素以防止感染〔6〕;将OP大鼠分为OPF组、低剂量组(10 mg/kg蛇床子素)、高剂量组(20 mg/kg蛇床子素)〔7〕、高剂量+NC组(2 μl shRNA)、高剂量+shRNA-BMP2组(2 μl shRNA-BMP2),15只/组,除Sham组及OPF组外其余组灌胃相应剂量蛇床子素,而OPF组及Sham组则灌胃等量的生理盐水,高剂量+NC组、高剂量+shRNA-BMP2组在灌胃第1天于尾静脉注射2 μl相应剂量慢病毒,其余组则注射等量生理盐水,灌胃8 w(1次/d)后备用。

1.4骨痂部位BMD检测 在OP模型构建后及灌胃结束后分别麻醉各组大鼠,以骨痂为中心使用双能X线BMD仪检测骨痂BMD(扫描模式:速度:60 mm/s,分辨率:1 mm×1 mm)。

1.5血清骨代谢指标TRACP和ALP水平检测 于大鼠腹主动脉血抽取3 ml血液后静置0.5 h,经过3 000 r/min离心(10 min)后分离出血清并使用试剂盒检测血清TRACP和ALP水平。

1.6三点弯曲实验进行股骨生物力学性能检测 每组随机选取5只大鼠,分离右侧股骨去除周围的软组织后取出克氏针,将股骨放置到生物力学试验仪器上,以中点作加压点,2 mm/min加载速度施压到股骨断裂,并通过计算机计算最大载荷、刚度。

1.7Micro-CT扫描股骨骨痂 每组另外取5只大鼠右侧股骨,使用Micro-CT以股骨骨折处为中心扫描,CT-Analyser软件分析骨痂的骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)、骨体积分数(BV/TV,骨体积/组织体积)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.8HE染色观察大鼠骨痂组织形态 取显微扫描后的股骨骨痂组织,放入多聚甲醛中固定2 d后使用硝酸溶液中(8%)脱钙6 w后制作成石蜡切片(4 μm),使用二甲苯进行2次脱蜡及水化,HE染色后封片,光镜下选取5个视野观察(×200)。

1.9Western印迹检测骨痂组织Osterix、RUNX2及BMP2/Smad4通路蛋白表达 取每组剩余大鼠股骨骨痂组织,使用裂解液将组织裂解后提取其中的总蛋白,BCA法定量所得蛋白浓度,每组以40 μg蛋白样品上样,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用牛血清白蛋白将膜进行1 h的封闭,兔抗RUNX2、BMP2、Smad4、Osterix、β-actin抗体(1∶1 000)孵育过夜后进行2 h的二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG,1∶5 000)孵育,经TBST洗膜后滴加1 ml ECL化学发光试剂进行显色,凝胶成像仪曝光并观察,测定RUNX2、BMP2、Smad4、Osterix、β-actin灰度值,计算各蛋白水平(n=5)。

1.10统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析,两组间采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1蛇床子素对大鼠股骨骨痂BMD影响 与Sham组比较〔(0.268±0.032)g/cm2〕,OPF组股骨骨痂BMD〔(0.126±0.020)g/cm2〕显著减小(P<0.05);与OPF组比较,低、高剂量组BMD依次显著升高〔(0.164±0.024)、(0.201±0.022)g/cm2,P<0.05〕;与高剂量组比较,高剂量+NC组BMD无明显变化〔(0.202±0.023)g/cm2,P>0.05〕,高剂量+shRNA-BMP2组BMD显著减小〔(0.140±0.020)g/cm2,P<0.05〕。

2.2蛇床子素对大鼠血清TRACP和ALP水平的影响 与Sham组比较,OPF组血清TRACP显著升高,ALP水平显著降低(P<0.05);与OPF组比较,低、高剂量组TRACP水平依次显著降低,ALP水平显著升高(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+NC组TRACP和ALP水平无明显变化(P>0.05),高剂量+shRNA-BMP2组TRACP水平显著升高,ALP水平显著降低(P<0.05),见表1。

2.3蛇床子素对大鼠生物力学性能的影响 与Sham组比较,OPF组股骨刚度及最大载荷显著减小(P<0.05);与OPF组比较,低、高剂量组刚度及最大载荷显著增大(P<0.05);相较于高剂量组,高剂量+NC组刚度及最大载荷无明显变化(P>0.05),高剂量+shRNA-BMP2组刚度及最大载荷显著减小(P<0.05),见表1。

2.4蛇床子素对大鼠骨折愈合相关指标的影响 与Sham组比较,OPF组BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著减小,Tb.Sp显著增大(P<0.05);与OPF组比较,低、高剂量组BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著增大,Tb.Sp显著减小(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+NC组BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp无明显变化(P>0.05),高剂量+shRNA-BMP2组BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著减小,Tb.Sp显著增大(P<0.05),见表1、图1。

表1 各组血清TRACP、ALP水平、生物学性能、骨折愈合相关指标

图1 各组股骨显微CT切面

2.5骨痂组织形态学观察 Sham组大量形成骨小梁,相互交织成网状,排列紧密且厚度均匀;OPF组骨小梁细薄且显著减少,缺乏连接且稀疏排列,成骨细胞少;与OPF组比较,低、高剂量组、高剂量+NC组骨小梁明显增粗且数目增多,相互交织成网状且间隙较小、成骨细胞的数量存在不同程度增多;与高剂量组比较,高剂量+shRNA-BMP2组上股骨愈合程度减慢,见图2。

图2 各组骨痂组织形态(HE染色,×200)

2.6蛇床子素对骨痂组织RUNX2、Osterix表达的影响 与Sham组比较,OPF组骨痂组织RUNX2、Osterix表达显著降低(P<0.05);与OPF组比较,低、高剂量组RUNX2、Osterix表达显著升高(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+NC组RUNX2、Osterix表达无明显变化(P>0.05),高剂量+shRNA-BMP2组RUNX2、Osterix表达显著降低(P<0.05),见表2、图3。

2.7蛇床子素对骨痂组织BMP2、Smad4表达的影响 与Sham组比较,OPF组骨痂组织BMP2、Smad4表达显著降低(P<0.05);与OPF组比较,低、高剂量组BMP2、Smad4表达显著升高(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+NC组BMP2、Smad4表达无明显变化(P>0.05),高剂量+shRNA-BMP2组BMP2、Smad4表达显著降低(P<0.05),见图3、表3。

表2 各组骨痂组织RUNX2、Osterix表达

1～6:Sham组,OPF组,低剂量组,高剂量组,高剂量+NC组,高剂量+shRNA-BMP2组图3 蛇床子素对骨痂组织RUNX2、Osterix、BMP2、Smad4表达的影响

表3 各组骨痂组织BMP2、Smad4表达

3 讨 论

OP患者由于骨骼退化或骨量减少造成骨骼脆性增加,从而导致OPF的发生,近年来OPF发生率不仅有所增加,还逐渐趋于年轻化〔8〕。目前,基于OPF的药物治疗集中于抑制破骨细胞功能或促进成骨上,而目前关于促进OPF患者愈合方面的抗OP药物选择性有限。因此,迫切需要寻找促进OPF愈合的新型药物〔9〕。

传统中草药对各种疾病的预防及治疗效果极佳,蛇床子素是从伞形科植物蛇床子中提取的有效活性成分,在OP治疗中具有很大的潜能〔10,11〕。蛇床子素通过激活cAMP/CREB信号途径来提高成骨相关因子Osterix表达,以此增强股骨骨折小鼠骨强度及促进骨折修复〔12〕。蛇床子素可抑制核因子κB受体活化因子配体(RANKL)所诱导的破骨细胞生成,以防止卵巢切除大鼠的骨质流失〔13〕。蛇床子素通过促进软骨细胞BMP-2和成骨标志物骨钙素(OCN)的表达来促进软骨内骨化,加速股骨开放性骨折小鼠骨融合及骨折修复〔4〕。本研究结果表明蛇床子素可显著改善OPF大鼠OP,增加生物力学强度,促进骨折愈合。

BMP在骨骼的发育、生长及骨折修复中均具有重要作用,BMP2作为其家族重要成员,参与骨骼的发育及组织构建,BMP2表达障碍患者易发生骨骼病及骨折〔1,14,15〕。BMP与其受体结合后可激活Smad途径,Smad4作为该途径中的信号分子已被证实通过在成骨及破骨细胞发育和功能中起到重要作用而参与调节骨代谢〔1,15〕。研究发现,Smad与RUNX2可通过相互作用共同参与调控成骨细胞的分化及表型基因表达〔8〕。miR-330-5p低表达可通过激活双糖链蛋白聚糖介导的BMP/Smad通路来抑制OP小鼠骨质流失〔16〕。蛙卵蛋白水解物可通过上调TGFβ/BMP2通路蛋白BMP2、Smad4表达增加OP大鼠Tb.Th,降低骨折风险〔17〕。雷奈酸锶可有效提高BMP-2和骨力学性能,加快OPF大鼠愈合期进程〔18〕。蛇床子素可通过激活雌激素-α/BMP-2/Smad通路体改OP大鼠生物力学特性及BMD,以此防治骨质流失,起到抗OP的作用〔19〕。本研究结果表明,蛇床子素在OPF大鼠中可激活BMP2/Smad4,与前人研究结果相似〔19〕。除此之外,本研究还发现,BMP2沉默表达可逆转蛇床子素对OPF大鼠OP的改善及骨折的愈合,该结果表明,蛇床子素可能通过激活BMP2/Smad4通路来促进OPF大鼠骨折处愈合。

综上,蛇床子素通过激活BMP2/Smad4信号通路来促进OPF大鼠的骨折处愈合。本研究不仅为OPF治疗新药的寻找提供参考,还可为临床中蛇床子素在OP及骨折中的应用提供参考。目前,本研究缺乏蛇床子素在OPF中更深层次的机制探讨,因此,这将成为接下来的首要研究内容。