姜黄素对重症肺炎大鼠心肌损伤的保护作用及信号通路调控机制

刘文曲

(安顺市人民医院,贵州 安顺 561000)

肺炎是发病率较高的常见疾病,其中重症肺炎持续存在的高热、呼吸受阻、肺功能受损等临床症状可带来更高风险的心肌损伤〔1,2〕。2018年全球累计肺炎病例因心肌损伤而致死近100万人,且呈逐年上升趋势〔3〕,因此重症肺炎心肌损伤是临床研究的热点。姜黄素是一种植物多酚类物质,可避免心脑血管病心肌细胞的炎症反应和氧化应激损伤,从而起到心肌保护作用,其作用机制可能与磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路蛋白表达的调控有关〔4,5〕。本研究观察姜黄素对重症肺炎大鼠心肌组织损伤的保护作用及PI3K/Akt信号通路蛋白的调控作用。

1 材料和方法

1.1实验动物 雄性健康SPF级的SD大鼠50只,购自贵州医科大学实验动物中心〔SCXK(黔)2018-0002〕;周龄8 w,体质量(200±10)g,饲养于贵州医科大学实验动物中心SPF级动物房〔SYXK(黔)2018-0001〕。动物在恒温(22±1)℃和恒湿(55±5)%、照度15～20 Lx的环境下饲养,每天光照和黑暗明暗交替时间为12 h/12 h,自由饮水和摄食,室内通风良好。动物术前在饲养环境下适应7 d。本实验研究方案经安顺市人民医院动物实验管理委员会讨论通过(编号:2019021)。实验过程遵循3R原则。

1.2主要试剂与仪器 注射用姜黄素购自西安天美生物科技股份有限公司,批号H381840,药品包装10 mg∶2 ml×8支;肺炎支原体(MP)国际标准菌液,购于首都儿科研究所,批号H430181,菌液浓度106CFU/ml;Akt蛋白抗体(编号CST#6849)、PI3K蛋白抗体(编号CST#8018)、实验指标蛋白抗体〔包括白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)的抗体〕均购自中杉金桥生物技术有限公司;通用型SP试剂盒(编号#SP-9000 WK152108)购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3动物造模 适应性喂养1 w后行滴鼻接种脂多糖(MP),仰卧位使大鼠头部轻微上扬,然后用无菌加样器吸取MP国际标准菌液1 ml(106CFU),缓慢滴入大鼠鼻腔,随着大鼠自然呼吸吸气时进入,接种后使大鼠保持直立位静置30 s,确保能促使菌液充分吸入,每日1次,连续4 d。造模实验3 d后取大鼠股动脉血进行血气指标〔氧分压(PaO2)、PaO2/吸氧分数(FiO2)〕分析,以动脉血气指标低于正常大鼠90%作为重症肺炎模型制作成功的标准〔6〕。实验后动物均按3R原则给予人道措施。每天观察实验动物的活动、精神状态、皮毛情况等,统计死亡动物数。

1.4动物分组、喂养、给药 大鼠随机分为肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只。另取10只未建模大鼠为正常组。参照《药理实验方法学》〔7〕中药物剂量折算方法(成人60 kg折算)给药。具体方法为:正常组及肺炎模型组均常规喂养;低剂量组、中剂量组、高剂量组除常规喂养外,按成人标准姜黄素剂量(0.02 mg/kg)分别注射0.5倍剂量(0.067 μg/kg)、1倍剂量(0.134 μg/kg)和2倍剂量(0.268 μg/kg)〔8,9〕,连续7 d。

1.5检测指标与方法 (1)心肌细胞生物学参数测定:各组实验大鼠于给药第8天处死并取心脏组织,以0.25%胰蛋白酶制成细胞密度为每毫升1×105个的悬溶液,铺设于标记组别的96孔板中,振摇后,48 h内采用德国巴鲁夫生物科学检测仪器测定细胞生物学参数。测定参数细胞存活数(D0)、平均细胞凋亡数(Dq)、细胞存活80%时所需时间(N)及细胞相对存活率值。细胞相对存活率=D0/正常组D0×100%。(2) 血清炎症因子、氧化应激因子和心脏组织蛋白表达检测:血清指标测定于给药第8天处死前股动脉取血,制备血浆,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和氧化应激因子〔ROS、MDA、总抗氧化能力(T-AOC)〕的表达水平;采用Western印迹法检测心脏组织的Akt、PI3K、P-Akt蛋白表达情况,组织匀浆、裂解后提取总蛋白,蛋白样品电泳并转移至聚偏氟乙烯膜上,室温密闭存放2 h后,以Akt蛋白抗体、PI3K蛋白抗体、p-Akt蛋白抗体,一抗孵育过夜,采用磷酸盐缓冲液洗膜,然后以辣根过氧化物二抗室温孵育1 h后洗涤显影,凝胶拍照封存并计算蛋白表达量。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、重复方差检验和q检验(Newman-Keuls法)。

2 结 果

2.1各组一般情况 实验期间,重症肺炎造模均成功,肺炎模型组和中剂量组各死亡1只。正常组PaO2、PaO2/FiO2明显高于肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组(P<0.01),肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的PaO2、PaO2/FiO2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。肺组织病理显示(图1):肺炎模型组与正常组相比,肺组织间隔明显增厚并有充血现象,肺泡肿大,大量炎细胞浸润;各药物组病变明显减轻,炎细胞浸润程度减轻,肺泡微水肿,有少量红细胞,且剂量越高,效果越好。

2.2心肌细胞生物学参数分析 与正常组比较,肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组D0、N、细胞相对存活率均显著下降,肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组Dq均显著提升(P<0.01),且与肺炎模型组比较,低、高、中剂量组D0、Dq、N、细胞相对存活率差异显著(P<0.01)。中剂量组D0、Dq、N、细胞相对存活率均显著高于低、高剂量组(P<0.01)。见表1。

表1 各组实验给药前血气指标及细胞化疗生物学参数、化疗增敏值比较

图1 各组肺组织(HE染色,×100)

2.3各组血清实验指标分析 与正常组比较,肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS、MDA均显著上升(P<0.01),T-AOC显著下降(P<0.01),且与肺炎模型组比较,低、高、中剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS、MDA均显著降低,T-AOC显著升高(P<0.01)。中剂量组上述指标均显著优于低、高剂量组(P<0.01)。见表2。

2.4各组PI3K/Akt信号通路蛋白表达量分析 与正常组比较,肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的Akt表达均显著上升(P<0.01),PI3K、P-Akt表达显著下降(P<0.01),且与肺炎模型组比较,低、高、中剂量组的PI3K/Akt信号通路蛋白表达量差异均有统计学意义(P<0.01)。中剂量组上述指标均显著优于低、高剂量组(P<0.01)。见表3、图2。

表2 各组心脏组织实验指标

表3 各组PI3K/Akt信号通路蛋白表达量

1～5:正常组、肺炎模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组图2 各组PI3K/Akt信号通路蛋白表达

3 讨 论

肺炎病因较为复杂,其发病机制、病理发展过程至今尚未完全明确,但临床普遍认同的是:肺部或全身性不可控感染而形成不可控炎性反应和氧化应激反应,最终可导致机体器官实质性损伤,可损伤心肌功能〔10〕。姜黄素具有抗心肌损伤的功效。冯敬媛等〔11〕研究显示,姜黄素可提升慢性心力衰竭大鼠心肌细胞生物学活性,改善慢性心力衰竭大鼠的心脏功能。另外有研究显示,姜黄素可通过抑制心肌组织炎症反应和氧化应激反应来改善心功能〔12〕。

血清TNF-α是机体炎症反应的起始因子,是可促进心肌细胞损伤的重要诱导炎性因子〔13〕。另外由单核巨噬细胞分泌合成的血清IL-6、IL-1β炎性因子可参与细胞的增殖、凋亡过程,其高炎性反应可抑制心肌细胞活性,从而抑制心肌细胞生物活性〔14〕。氧化应激因子也是心肌细胞损伤的重要因素,在ROS高表达时,心肌细胞受氧化平衡影响而导致心肌细胞氧化损伤,MDA也可起到与ROS相似的心肌细胞氧化损伤作用〔15〕;T-AOC低表达可使机体产生大量超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶,从而打破机体氧化防御体系,也可产生心肌细胞氧化损伤作用〔16〕。本研究结果提示,姜黄素可改善炎性因子、氧化应激因子的表达,从而减轻心肌细胞损伤,起到心肌保护作用。PI3K/Akt通路是目前心肌细胞损伤的重要信号转导通道,在该信号通路中,Akt和P-Akt均是PI3K的下游基因表达基因,Akt高表达和p-Akt低表达均可诱导丝氨酸残基底物磷酸化,从而激活或抑制心肌细胞的炎性因子和氧化应激因子的异常表达,导致心肌细胞损伤〔17〕。在心肌损伤动物模型中,炎症反应和氧化应激反应可持续存在,如炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的高表达,氧化应激因子ROS、MDA、T-AOC的异常表达均可激活心肌损伤信号分子通路,最终导致心肌细胞损伤〔18〕。Mohamed 等〔19〕认为PI3K/Akt通路激活,可促进大量促炎因子高表达,形成炎症级联放大反应,在病变组织中形成炎症“瀑布”反应,从而打破心肌细胞氧化平衡,导致心肌损伤。本研究结果提示,调控PI3K/Akt信号通路蛋白的表达可能是姜黄素改善炎性因子、氧化应激因子对心肌细胞损伤的重要原因。