化浊解毒疏肝方对肝郁型功能性消化不良大鼠内脏敏感性及MAPK通路的影响

张玉卓 王立美 张亚秋 贾文文 王娜 王丽丽

(1河北省中医药科学院内科,河北 石家庄 050031;2石家庄市人民医院心内科;3河北省中医院脾胃科)

功能性消化不良(FD)是一种临床综合征,其特征是上腹部疼痛或烧灼感、早饱、饭中或饭后饱胀,这些症状可导致胃功能障碍〔1〕。FD的发病机制较为复杂,内脏高敏感性被认为是FD发病的重要机制〔2〕。目前西医学对于 FD的治疗主要是从控制饮食、抑制胃酸及抗焦虑抑郁等方面入手,但治疗效果不佳〔3〕。中医学则认为肝郁是FD的主要发病机制〔4〕,中医通过辨证论治治疗FD取得了良好的成效〔5〕。李佃贵教授认为,饮食不节,肝气不舒,或气郁化火、肝胆湿热致使脾胃升降失和,运化受阻,浊毒内蕴而引发消化系统疾病〔6〕,治疗多以化浊解毒调肝中药为主,临床应用多年,确有奇效。已有研究报道,化浊解毒调肝法可用于治疗慢性萎缩性胃炎〔7〕。但关于化浊解毒疏肝方对肝郁型功能性消化不良大鼠内脏敏感性的影响尚不清楚,因此,本研究通过构建FD大鼠模型,探讨化浊解毒疏肝方对FD大鼠模型抑郁状态、胃肠动力、胃敏感性的影响及其可能的作用机制,旨在为FD的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1验动物 90只雄性Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号为SCXK(甘)2018-0003。动物实验均遵循3R原则,并得到医院动物伦理委员会的批准。

1.2主要试剂 5-羟色胺(HT)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(货号:JL10725)购自上海江莱生物科技有限公司;兔源一抗磷酸化(p)-细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2(货号:K006217P)、ERK1/2(货号:K106589P)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,货号:K000027M )及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(货号:se134 )均购自北京索莱宝生物科技有限公司;p-p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抗体(货号:3438-100)购自艾美捷科技有限公司;p38MAPK抗体(货号:ab4822)购自英国Abcam公司;电化学发光(ECL)试剂盒(货号:10001)购自北京科宇深蓝科技有限公司。

1.3化浊解毒疏肝方的制备 化浊解毒疏肝方由黄芩12 g、罗勒6 g、石菖蒲9 g、佩兰9 g、藿香9 g、柴胡12 g、枳壳9 g、绞股蓝12 g等组成,首先将上述药物中加水浸泡1 h,然后煎煮2次,每次50 min,将2次煎液混合,浓缩成含生药0.7、1.4、2.8 g/ml,置于4 ℃保存。

1.4FD模型的构建 参考文献〔8〕复制FD模型,每天上午8点开始,用包裹有海绵的长止血钳夹住大鼠尾部末端1/3处,通过该手段激怒大鼠使其相互厮打,每次夹尾持续时间为30 min,连续10 d,交替进行多种刺激:禁水禁食24 h、冷水下强迫游泳、昼夜颠倒、45 °倾斜笼子24 h。每天随机不重复进行刺激,若大鼠出现饮食量减少,精神倦怠,毛发枯燥无光泽,易怒等症状,则视为造模成功。

1.5实验分组 大鼠随机分为对照组、模型组、化浊解毒疏肝方低剂量(中药低剂量)组、化浊解毒疏肝方中剂量(中药中剂量)组、化浊解毒疏肝方高剂量(中药高剂量)组、阳性对照(多潘立酮)组,每组15只。除对照组外,其他组均需构建FD模型,造模成功后,参考文献〔9,10〕及前期预实验结果,中药低、中、高剂量组分别按照7、14、28 g/kg的剂量灌胃,多潘立酮组按照10 mg/kg的剂量灌胃多潘立酮,对照组、模型组灌胃等量的生理盐水,各组每日药物处理1次,持续处理21 d。

1.6大鼠一般状态观察 观察并记录末次给药结束后大鼠精神状态、自由活动、饮食情况、皮毛生长及大便情况。

1.7糖水偏好实验和旷场实验 参考文献〔11〕进行糖水偏好实验。大鼠接受48 h的适应训练,适应训练24 h后进行1 h的糖水偏好测试。在48 h的适应训练中,将一瓶装有1%蔗糖溶液的水瓶、一瓶装有自来水的水瓶分别放置在喂食隔间的左侧和右侧,每12 h更换一次,以防止惯性依赖造成的误差。 适应训练结束后,仅提供自来水6 h,然后禁止大鼠进食和饮水18 h。 随后,在测试阶段,给予大鼠两个瓶子;一个为1%蔗糖溶液,另一个是自来水,1 h后,取走瓶子,糖水消耗率(%)=(糖水摄入量/总液体摄入量)×100%。

参考文献〔12〕进行旷场实验。将大鼠放在长、宽、高分别为70、70、40 cm的自制箱中,箱的内壁为黑色,箱的底面为25个10 cm×10 cm的正方形,水平得分为5 min内大鼠三爪以上进入箱底正方形数,进入一个为1分;垂直得分为双前肢抬起高度超过1 cm的次数,每1次计1分。

1.8大鼠胃排空率及小肠推进率测定〔10〕各组选取5只大鼠,术前12 h禁食不禁水,灌胃营养性半固体糊,30 min后腹腔注射10%水合氯醛麻醉并处死大鼠,取出完整胃,称取质量为全质量;剪开胃壁并用生理盐水洗净,滤纸吸干,称取质量为净质量,胃排空率(%)=(全质量-净质量)/全质量×100%。取小肠全段,测量小肠总长度及幽门到营养性半固体糊上缘的距离,小肠推进率(%)=营养性半固体糊推进距离/小肠全长×100%。

1.9大鼠胃敏感性分析〔3〕经口将连接球囊的聚乙烯管插入麻醉大鼠的胃中,将2根金属电极分别固定在大鼠两侧斜方肌用来记录肌电活动。大鼠醒后,分别以20、40、60 mmHg的压力向球囊施加压力,每次持续30 s,每3 min 1次。以颈斜方肌肌电均方根变化率作为胃敏感性的评价指标,均方根变化率=(加压期均方根-基础均方根)/基础均方根×100%。

1.10苏木素-伊红(HE)染色检测大鼠胃窦组织病理变化 将固定在4%多聚甲醛中的胃窦组织用乙醇溶液脱水,并进行石蜡包埋,切成5 μm厚的切片,脱蜡,再水化,用苏木素和伊红染色,在光学显微镜下观察大鼠胃窦组织病理变化。

1.11ELISA检测胃组织匀浆中5-HT水平 将各组剩余的10只大鼠处死,收集胃组织及胃窦,胃窦固定于4%多聚甲醛中,胃组织保存于-80 ℃中。严格按照5-HT ELISA检测试剂盒说明书检测胃组织匀浆中5-HT水平。

1.12Western印迹检测胃组织中MAPK通路相关蛋白 使用RIPA裂解缓冲液裂解并提取胃组织匀浆中的总蛋白,并通过二辛可宁酸测定进行蛋白质定量,蛋白质经电泳、转膜、封闭后,加入一抗p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH在4 ℃下孵育过夜,再加入HRP耦联的羊抗兔二抗在常温下孵育1 h,最后通过ECL试剂盒检测蛋白印迹情况。

1.13统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组一般情况比较 对照组精神状态良好,饮水和饮食正常,活动正常,皮毛光亮且光滑,粪便正常;模型组出现皮毛光泽度变差、活动能力下降、饮食量减少、易暴怒、大便不成形等现象;中药低、中、高剂量组精神状态相对稳定,皮毛光泽度有所改善,大便逐渐成形,且呈剂量依赖性;多潘立酮组一般情况与化浊解毒疏肝方高剂量组无明显差异。

2.2各组糖水消耗率及旷场实验得分比较 与对照组比较,模型组糖水消耗率、旷场实验水平得分、垂直得分显著降低(P<0.05);与模型组比较,中药低、中、高剂量组糖水消耗率、旷场实验水平得分、垂直得分显著升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);中药高剂量组与多潘立酮组上述指标差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.3各组胃排空率及小肠推进率比较 与对照组比较,模型组胃排空率、小肠推进率显著降低(P<0.05);与模型组比较,多潘立酮组和中药低、中、高剂量组胃排空率、小肠推进率显著升高(P<0.05),见表1。

2.4各组胃窦组织病理变化比较 对照组胃窦组织结构完整,无炎性细胞浸润;模型组胃窦黏膜伴有炎性细胞浸润;与模型组比较,中药低、中、高剂量组和多潘立酮组胃窦组织可见少量炎性细胞浸润,但严重程度不及模型组,见图1。

2.5各组胃敏感性比较 与对照组比较,模型组在20、40、60 mmHg压力下的颈斜方肌肌电均方根变化率显著升高(P<0.05);与模型组比较,中药低、中、高剂量组20、40、60 mmHg压力下的颈斜方肌肌电均方根变化率显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);中药高剂量组与多潘立酮组上述指标差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.6各组胃组织匀浆中5-HT水平比较 与对照组比较,模型组胃组织匀浆中5-HT水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,中药低、中、高剂量组胃组织匀浆中5-HT水平显著升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);中药高剂量组与多潘立酮组上述指标差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.7各组胃组织中MAPK通路相关蛋白表达比较 与对照组比较,模型组胃组织中 p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38MAPK/p38MAPK水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,中药低、中、高剂量组胃组织中 p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38MAPK/p38MAPK水平显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);中药高剂量组与多潘立酮组上述指标差异无统计学意义(P>0.05),见表2、图2。

表1 各组糖水消耗率及旷场实验得分及胃排空率和小肠推进率比较

图1 各组胃窦组织病理(HE染色,×200)

表2 各组颈斜方肌肌电均方根变化率及胃组织匀浆中5-HT水平和MAPK通路相关蛋白表达比较

1～6:对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、多潘立酮组图2 Western印迹检测各组胃组织MAPK通路相关蛋白表达

3 讨 论

FD是一种常见的功能性胃肠病,其患病率接近20%〔13〕。该病不仅影响患者生活质量,还给医疗保健系统带来了巨大的经济负担〔14〕。据报道,FD除胃肠道功能障碍外,约50%患者同时存在抑郁和焦虑等情感行为,且胃肠道功能障碍的严重程度与抑郁和焦虑的得分呈正比关系〔15〕。本研究采用慢性应激刺激法构建FD大鼠模型,结果发现,模型组大鼠出现皮毛光泽度变差、活动能力下降、饮食量减少、易暴怒、大便不成形等现象,提示造模成功。本研究还通过糖水偏好实验和旷场实验来评估大鼠的抑郁状态,结果发现,FD大鼠模型伴有抑郁状态。胃肠运动功能紊乱是FD发生的主要生理病理改变之一〔16〕,5-HT作为一种单胺类神经递质物质,具有调节精神情绪及胃肠道动力的作用,其含量降低可导致胃肠推动力的下降〔17〕。本研究结果表明,FD模型大鼠胃肠运动功能紊乱。据报道,30%～40%的FD患者存在胃高敏感性,且胃敏感性的增加与上腹痛等症状的发生密切相关〔18〕。本研究提示,FD模型大鼠胃敏感性升高;采用慢性应激刺激法构建FD大鼠模型具有胃肠运动功能紊乱、伴有抑郁、胃敏感性升高等特点。

中医学认为,FD属于“胃脘痛”“痞满”等范畴。由于饮食习惯、结构的改变及生活工作压力的骤增,目前饮食不节、情志不舒多是FD发病的主要病因之一,饮食不节,则脾胃失和,清阳不升,浊阴不降,湿热痰浊蕴结中焦,积久成热成毒;情志不舒,肝失条达,则肝胃不和,湿热久郁成瘀成毒,体内外浊毒缠绵胶着,互相搏结,致使脾胃不和,引发FD〔6〕。因此,FD病位在脾、胃、肝,治疗多以化浊解毒疏肝中药为主。化浊解毒疏肝方中罗勒、黄芩具有化湿解毒之功效,柴胡、枳壳具有理气消积的作用,而藿香、佩兰、绞股蓝、石菖蒲等发挥了芳香化浊的作用。据报道,化浊解毒疏肝方可激活Rac1-cofilin通路发挥抗抑郁作用〔19〕;化浊解毒疏肝方治疗胆汁反流性胃炎疗效明显〔20〕。本研究结果提示,化浊解毒疏肝方对FD大鼠具有较好的治疗作用。

MAPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,该通路在炎症、肿瘤等一系列疾病的病理生理过程中发挥重要作用〔21〕,并协同参与对肠道局部免疫及内脏高敏性的调控〔22〕。机体内脑肠肽水平异常或者体内外异常刺激均可直接或间接激活MAPK信号通路,通路中ERK1/2、P38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)被大量活化,从而产生级联反应。其中下游靶基因原癌基因(c-fos)是被公认的伤害性刺激神经元的标志物,当其表达异常增加时,会提升痛觉敏感性,使痛阈下调,导致功能性肠病呈现超高敏状态〔23〕,进而出现腹痛、腹胀、抑郁等一系列临床症状。已有研究报道,促肾上腺皮质激素释放因子通过激活MAPK通路诱导低度炎症,进而导致FD〔24〕。本研究表明,化浊解毒疏肝方对FD大鼠抑郁状态及胃肠运动功能的改善作用,对胃敏感性的降低作用可能与抑制MAPK通路有关。

综上,化浊解毒疏肝方可显著改善FD大鼠抑郁状态及胃肠运动功能,并降低胃敏感性,该机制可能与抑制MAPK通路有关,然而具体机制是否与MAPK通路有关,有待后续实验深入探究。