M2型巨噬细胞来源外泌体对食管癌细胞生长行为及人脐静脉血管内皮细胞血管生成的影响

王玉萍 刘约瑟 张玉珂 李登科 王玲玲

(河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)肿瘤内科,河南 郑州 450000)

食管癌是消化道内常见的恶性肿瘤之一,作为全球第八大癌症严重威胁着人类健康。食管癌患者早期可能出现乏力、恶心、体质量减轻等非特异性症状,因此难以诊断,大多数患者在确诊时已处于肿瘤晚期,易转移性和高侵袭性是导致该疾病致死率高的两大因素。目前食管癌患者总体的5年生存率约为20%〔1,2〕。目前临床上食管癌的治疗从一定程度上提高了患者的总生存率,然而,由于一半以上的患者在临床确诊时已发生远处转移,此外,复发和放化学抗性也直接影响患者的预后〔3,4〕。目前,对食管癌的发病机制和进展机制缺乏明确的认识,这是开发食管癌有效诊断和治疗方案的主要障碍。

巨噬细胞通常分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞的活化受到干扰素(IFN)-γ等因素的刺激,极化的M1型巨噬细胞能够触发促炎反应和促进免疫刺激因子的产生,这些因子包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等,在肿瘤中发挥抵抗作用;M2型巨噬细胞能够进一步细分为M2a、M2b、M2c和M2d亚型,其中,M2a、M2b和M2c亚型通过特异性高表达重组人精氨酸酶(Arg)1、转化生长因子(TGF)-β等因子进而发挥抗炎和促肿瘤作用〔5,6〕。外泌体(Exo)是由多数细胞释放的直径在30～150 nm的脂质双层膜囊泡,含有蛋白质、脂质和核酸等多种生物成分,在功能上能够从亲本细胞转移到受体细胞。先前的研究表明,Exo是肿瘤微环境中不同类型细胞之间的关键通信介质〔7〕,然而,目前大多数研究都集中在肿瘤细胞来源的Exo上,关于M2型巨噬细胞Exo及其对肿瘤细胞影响的报道相对较少。鉴于此,本研究拟在体外诱导M2型巨噬细胞,并分离其Exo以探究M2型巨噬细胞来源的Exo途径在食管癌细胞生长、转移及血管生成中的作用。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和食管癌细胞株EC9706(中国科学院上海生命科学研究院细胞库),胎牛血清、RPMI1640培养基及白细胞介素(IL)-4(美国Gibco公司),佛波酯(PMA,美国Sigma公司),Trizol试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量(qRT)-PCR试剂盒(日本Takara公司),Exo提取试剂盒(上海贝博生物),亲脂性荧光染料(PKH67)试剂盒(德国Millipore公司),CCK-8试剂盒和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)试剂盒(北京康为世纪生物),Transwell小室和基质胶(美国Corning公司),聚偏氟乙烯(PVDF)膜、电化学光(ECL)液和结晶紫(上海碧云天生物研究所),抗体CD9、CD63、Tsg101及GAPDH等(英国Abcam公司)。基因引物序列交由上海生工生物工程公司构建。

1.2M2型巨噬细胞的诱导 使用10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养THP-1细胞。待细胞呈对数生长时,调整密度为1×105个/孔接种于6孔培养板,过夜孵育待其贴壁后,以10 ng/ml PMA刺激培养72 h,再以40 ng/ml IL-4刺激培养24 h,诱导向M2型巨噬细胞极化,该处理记为实验组,并以正常培养的THP-1细胞作为对照组。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测巨噬细胞相关基因表达 细胞诱导结束后,Trizol法提取细胞总RNA。根据反转录试剂盒说明书操作将RNA逆转录合成为cDNA,采用qRT-PCR实验进行扩增,实验操作具体按照荧光定量SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书完成,以GAPDH作为内参基因,程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s(重复40个循环),Primer premier 5.0软件设计引物序列,各基因引物序列(5′-3′):TNF-α正向CCTCCCTCTCATCAGTTCTA,反向ACTTGGTGGTTTGCTACGAC;IL-6正向CCCCAATTTCCAATGCTC-TCC,反向TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC;iNOS正向CAGAGGACCCAGAGACAAGC,反向TGCTGAAAC-ATTTCCTGTGC;Arg1正向AGTGTGGTGCTGGGTGGAGAC,反向GCTGGTTGTCAGGGGAGTGT;TGF-β正向TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC,反向GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA;CD206正向CAGGTGTG-GGCTCAGGTAGT,反向TGTGGTGAGCTGAAAGGTGA;GAPDH正向TGAAGCAGGCATCTGAGGG,反向CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG。实验结果使用2-ΔΔCt法计算,比较两组细胞中各基因mRNA上的表达差异。

1.4Exo的提取与鉴定 收集诱导的M2型巨噬细胞上清液,4 ℃低温冷冻离心机中以4 633 r/min离心15 min,去除沉淀;继续4 ℃,8 459 r/min离心30 min,弃沉淀并收集上清液。通过0.22 μm滤膜过滤后,加入Exo提取试剂液A,4 ℃静置12 h,再4 ℃,8 459 r/min离心60 min,保留沉淀并加入保存液试剂B重悬沉淀。通过使用透射电镜观察颗粒物的形态、粒径分析仪检测粒径分布及Western印迹法检测CD9、CD63及Tsg101的蛋白表达情况来鉴定分离的Exo。

1.5Western印迹检测Exo标志蛋白表达 在Exo中加入预冷的放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液进行裂解,考马斯亮蓝法进行蛋白定量。测定蛋白浓度后,取等量样品,98 ℃水浴锅中加热15 min后离心。上样后经过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白,200 mA转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入稀释好的一抗工作液,4 ℃摇床孵育过夜。次日TBST洗膜,加入相应稀释后的二抗工作液,随后加入化学发光液ECL显色,凝胶成像系统拍照,以GAPDH作为内参蛋白。

1.6细胞免疫荧光染色检测Exo传递 取分离的Exo悬液200 μl,加入等量稀释液混合均匀,再取1.6 μl PKH67染液,添加200 μl稀释液对染液进行稀释,将稀释后的Exo悬液与稀释后的PKH67溶液混合,轻轻吹打混匀,避光染色5 min,加入0.1%牛血清白蛋白(BSA)溶液终止染色。4 ℃,9 266 r/min离心20 min,弃上清,重悬沉淀后,将其加入培养的EC9706细胞中(M2-Exo+EC9706组),两者共孵育24 h。EC9706细胞为对照(EC9706)组。孵育结束后,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min,封片、干燥,通过荧光显微镜观察EC9706细胞对荧光标记的Exo的摄取情况。

1.7CCK-8法检测细胞增殖活性 将对数生长期的EC9706细胞按1×105个/孔接种于96孔培养板中,置于37 ℃、5%CO2条件下过夜培养。次日,加入0.1 mg/ml Exo与细胞共培养(M2-Exo+EC9706组),未加Exo的为对照(EC9706组),于24、48、72 h时,加入10 μl CCK-8试剂液至待测细胞孔,继续孵育4 h,通过全自动酶标仪测定450 nm处各孔细胞的光密度(OD)值。

1.8EdU实验检测细胞增殖水平 收集EC9706细胞或与Exo共培养48 h的EC9706细胞(M2-Exo+EC9706组),未加Exo的为对照(EC9706组),按1×105个/孔接种在24孔板,置于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h,次日,加入10 μmol/L EdU试剂液,培养2 h后,滴加4%多聚甲醛,室温下固定20 min,加入甘氨酸孵育5 min,0.5% Triton X-100穿膜处理10 min,利用Apollo567在避光条件下室温染色30 min,结束后采用甲醇清洗细胞,再用DAPI染核,干燥、封片,通过激光共聚焦显微镜观察染色情况。

1.9Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 收集EC9706细胞或与Exo共培养48 h的EC9706细胞(M2-Exo+EC9706组),未加Exo的为对照(EC9706组),调整密度为2×104个/ml。在Transwell小室的上室加入稀释后的基质胶进行包被,待胶凝固后,吸取200 μl细胞悬液加入上室,下室加入600 μl含10%胎牛血清的细胞培养液,置于37 ℃、5%CO2条件下过夜培养。次日,取出小室,加入4%多聚甲醛,室温固定30 min,再用0.1%结晶紫染色10 min,通过光学显微镜拍摄图像并记录统计。细胞迁移检测实验不在Transwell小室的上室铺基质胶,其余操作步骤均与上述一致。

1.10HUVEC的成管实验 将稀释后的基质胶均匀平铺于24孔板孔底,置于37 ℃条件下待胶凝固。取对数生长期的HUVEC,0.25%胰蛋白酶消化,调整浓度为1×105个/ml,加入0.1 mg/ml Exo与HUVEC共培养24 h后,将处理后的HUVEC均匀接种于铺好基质胶的24孔板上,置于37 ℃、5%CO2条件下培养48 h,通过倒置生物显微镜观察HUVEC管腔形成情况并拍摄图像,ImageJ软件分析形成管的长度。

1.11统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1诱导后M2型巨噬细胞的鉴定结果 实验组TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表达水平较对照组显著下调(P<0.001),M2型巨噬细胞相关基因Arg1、TGF-β和巨噬细胞CD206的mRNA表达水平均较对照组显著上调(P<0.001),见表1。

2.2M2型巨噬细胞Exo的分离与鉴定结果 通过透射电镜观察到分离的颗粒物为典型的球状小囊泡。纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)测量发现该粒度直径峰值大约分布在100 nm。Western印迹检测到Exo标志蛋白CD9、CD63和TSG101均高水平表达,由此判断分离的颗粒物为Exo,见图1、表2。

表1 两组巨噬细胞表型相关基因表达水平比较

图1 Exo的鉴定

表2 M2型巨噬细胞与M2型巨噬细胞来源Exo中CD9、CD63和TSG101蛋白表达水平比较

2.3M2型巨噬细胞来源Exo传递到EC9706细胞检测结果 将分离的M2型巨噬细胞来源Exo与EC9706细胞共培养,在荧光显微镜可见经过PKH67标记的Exo分布于EC9706细胞的细胞核周围,可见有明显绿色荧光标记的Exo表达,说明Exo可被EC9706细胞摄取,而未与Exo共培养的EC9706细胞周围无绿色荧光表达,见图2。

2.4M2型巨噬细胞来源Exo对EC9706细胞增殖的影响 EdU染色结果中EdU阳性红色细胞为增殖细胞,M2-Exo+EC9706组细胞内EdU阳性细胞数较单纯培养的EC9706组显著增加(P<0.001)。CCK-8法检测结果显示,与EC9706细胞比较,经过与M2型巨噬细胞来源Exo共培养的EC9706细胞,在处理24、48及72 h后,细胞的增殖活性显著升高(P<0.001),见图3、表3。

图2 免疫荧光染色观察Exo被EC9706细胞摄取情况(×100)

2.5M2型巨噬细胞来源Exo对EC9706细胞迁移与侵袭的影响 Transwell实验结果显示,与EC9706组,与M2-Exo+EC9706组迁移数目与侵袭数目均显著增加(P<0.001),见表3、图4。

2.6M2型巨噬细胞来源Exo对HUVEC血管生成的影响 成管实验检测结果显示,M2-Exo+HUVEC组形成的小管长度较HUVEC组显著增加〔(24.45±2.27)vs(17.63±1.45)mm;t=87.149,P=0.000〕,见图5。

表3 M2型巨噬细胞来源Exo对EC9706细胞增殖、迁移与侵袭、HUVEC形成小管长度的影响

图4 M2型巨噬细胞来源Exo对EC9706细胞迁移与侵袭的影响(结晶紫染色,×100)

图5 M2型巨噬细胞来源Exo对HUVEC血管生成的影响(×200)

3 讨 论

肿瘤细胞与其周围微环境之间有相互作用,且细胞外基质在促进肿瘤进展方面有重要作用。肿瘤的间质成分由内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和炎症细胞等组成,这些细胞会创造一个微环境从而改变肿瘤细胞的特性,并参与肿瘤的发展过程及对治疗方案的反应〔6,8〕。作为食管癌肿瘤微环境的常见组成部分,肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过分泌多种生长因子和细胞因子来促进肿瘤发展。一般来说,巨噬细胞具有极化为M1型或M2型的特性,其中,TAM在表型和功能上均倾向M2表型,能够抑制抗肿瘤免疫反应、调节肿瘤细胞耐药性及加速肿瘤血管生成〔9,10〕。近年来,关于TAM与多种肿瘤之间的联系已被研究者们明确,TAM为潜在的癌症治疗靶点。

随着肿瘤的持续生长,肿瘤细胞通过一些途径如血液、淋巴液等转移到其他部位生成肿瘤,这种肿瘤称为继发性肿瘤。肿瘤的这种继发性生长源于多步骤过程,其中原发性肿瘤细胞从原发部位脱离,侵入组织基底膜并导致细胞间黏附能力丧失,这增强了肿瘤细胞的迁移潜能及向血管或淋巴管的内渗,肿瘤细胞通过循环系统运输并最终移动到远处〔4,11,12〕。肿瘤基质细胞来源的Exo是肿瘤微环境中细胞间通讯的主要媒介,在肿瘤转移中发挥关键作用。例如,Lan等〔13〕研究表明M2型巨噬细胞调节结直肠癌细胞的迁移和侵袭取决于M2型巨噬细胞来源的Exo,M2型巨噬细胞来源的Exo能够促进结肠癌中细胞迁移和侵袭的潜能;Wu等〔14〕研究发现,整合素αMβ2(CD11b/CD18)在M2型巨噬细胞来源的Exo中具有显著的特异性和有效性,阻断CD11b和(或)CD18能够致使M2型巨噬细胞来源的Exo介导的肝细胞癌细胞转移明显减少,从机制上讲,M2型巨噬细胞来源的Exo介导CD11b/CD18的细胞间转移,从而激活受体肝细胞癌细胞中的基质金属蛋白酶-9信号途径以促进肿瘤发生迁移。与上述研究结果一致,本研究通过使用M2型巨噬细胞来源的Exo与食管癌细胞系EC9706共培养后发现,该作用增加了EC9706细胞的增殖活性,并促进了细胞的转移与侵袭能力。

肿瘤血管能够为肿瘤细胞提供氧气与营养物质以维持其生长及扩散,因此,血管生成对于癌症的发展和转移至关重要,靶向抑制肿瘤血管生成也是食管癌治疗的一个重要手段〔15〕。研究表明,M2型巨噬细胞可通过旁分泌效应调控血管周围环境和相关细胞生长及迁移。Yang等〔16〕研究指出,M2型巨噬细胞来源的Exo可以促进体外小鼠主动脉内皮细胞的血管生成从而促进肿瘤的增长;Hughes等〔17〕揭示M2型巨噬细胞来源的Exo能够加速恶性肿瘤的血管生成,因为这种Exo可以释放IL-1β、VEGF、TNF-α 及其他一些促血管生成的细胞因子。在本研究中,通过将HUVEC与M2型巨噬细胞来源Exo共培养后,HUVEC的血管生成能力显著提高,这进一步验证了M2型巨噬细胞通过Exo途径促进肿瘤血管生成的作用。

综上,M2型巨噬细胞来源的Exo对食管癌肿瘤细胞生长、转移及血管生成有促进的作用,这为后续进一步探索靶向肿瘤微环境中M2型巨噬细胞来源的Exo从而建立食管癌治疗方案的探究奠定了实验基础。