富血小板纤维蛋白联合自体脂肪移植治疗糖尿病足溃疡的临床观察

陈志伟 姜涵译 郑碧遥 何静 徐刚

(1华北理工大学,河北 唐山 063000;2唐山市工人医院)

糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病患者严重的慢性并发症之一,具有较高的致残率和致死率,是非外伤性截肢的首要原因〔1〕。传统治疗主要通过药物控制和手术重建,但总体疗效欠佳,仍有相当多患者的DFU进展成慢性难愈性伤口。近年来,脂肪因具有再生潜能且易于获取、组织量丰富、安全性良好,在急慢性创面修复中备受青睐。有研究指出,自体脂肪移植(AFG)对DFU治疗具有较好疗效〔2〕。但由于脂肪对组织缺血较为敏感,植入后存活率低〔3〕,极大限制了临床上的运用。研究发现,富血小板纤维蛋白(PRF),除了自身能够促进创面愈合外,还能作为脂肪源性干细胞(ADCSs)的纤维蛋白支架,延长其在移植部位的停留时间,从而减少脂肪坏死,提高治疗效率〔4,5〕。因此本研究探讨PRF联合AFG治疗DFU的临床疗效,以期验证临床治疗效果。

1 对象与方法

1.1临床资料 共纳入唐山市工人医院烧伤整形科2019年9月至2021年4月收治的DFU患者60例,其中男42例、女18例;年龄35～77岁,平均(55.52±11.11)岁;体质量指数(BMI)23.2～28.2 kg/m2,平均(25.62±1.29)kg/m2;糖尿病足病程6～30个月,平均(14.65±5.48)个月;糖化血红蛋白(HbA1c)3.2～8.3 mg/dl,平均(5.63±1.32)mg/dl;初始溃疡面积2.24～8.23 cm2,平均(4.99±1.42)cm2;深度0.3～0.9 cm,平均(0.58±0.19)cm;踝肱指数0.90～1.30,平均(1.02±0.11);Wanger Ⅱ级28例、Ⅲ级32例。随机分为对照组、观察组(AFG组、PRF+AFG组),每组20例。3组基线资料差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组基线资料比较

1.2纳入与排除标准 纳入标准:年龄18～80岁;符合《糖尿病足诊疗指南》〔6〕诊断标准的Ⅱ型糖尿病患者;DFU溃疡大小超过0.5 cm×0.5 cm,<10 cm×10 cm;Wanger分级Ⅱ～Ⅲ级,踝肱指数大于0.9。排除标准:合并糖尿病酮症酸中毒;HbA1c>212 mg/dl;既往或目前有严重的心肺肝肾功能不全;不能耐受手术〔美国麻醉医师协会(ASA)分级>3级〕;患有自身免疫性疾病或免疫抑制应用者;恶性肿瘤患者;血小板计数<10×109/L、血红蛋白水平<9 g/dl。

1.3一般治疗 患者入院后完善相关术前检查,根据检查结果控制代谢紊乱(血糖、血脂、血压)并给予改善微循环、营养神经等治疗,创面分泌物细菌培养,根据药敏试验结果选择针对性抗生素控制炎症。

1.4手术清创 待术前准备完善后行手术清创,清除溃疡及周围坏死组织,对于界限不清的创面,尽可能保留健康组织,电凝止血,处理后的创面使用过氧化氢、生理盐水、爱可欣(长效抗菌敷料,深圳爱杰特医药)反复冲洗。

1.5术中处理 ①对照组:创面处理后,根据创面的大小选择适宜体积的医用海绵,裁剪成合适的形状,覆盖创面,可根据覆盖效果酌情在部分连接处用针线缝合固定避免海绵变形,用黏性半透膜包裹创面固定敷料,外接负压吸盘及引流罐,调节负压大小75～125 mmHg,接通并检查有无漏气。②AFG组:首先根据患者创面的长、宽、深度测量值估算体积大小得到脂肪预计需要量,抽吸量与预计需要量比值为4～5∶1。然后按Coleman技术提取脂肪,取患者腹部、大腿内外侧皮下脂肪丰富部位,采集前先注射肿胀液(2%利多卡因10 ml+肾上腺素0.5 mg+5%碳酸氢钠10 ml+生理盐水500 ml),充分浸润10 min。然后用孔径为3.0 mm/2.5 mm(腹部/大腿)带侧孔的吸脂针连接20 ml注射器,人为形成负压,在皮下脂肪层来回放射状抽吸,取脂后注射器用塞子密封,离心机3 000 r/min离心3 min,离心后内容物分为3层,上层主要为油脂,下层为血细胞、血浆、滤液等混合物,弃去上层油层及下层混合层后即获得所需移植的脂肪细胞,然后转移至多个1 ml的注射器内,在伤口边缘约1 cm处做切口,将脂肪从周围区域向溃疡方向或平行于伤口边缘逆行隧道注射,注意观察周边皮肤,避免过度填充。剩余的脂肪均匀地铺在创面上,余下负压操作同对照组。③AFG+PRF组:按照ChouKroun方法〔7〕制备PRF,抽取患者静脉血10 ml,置于无任何抗凝剂的无菌试管内,离心机3 000 r/min离心10 min,离心后管内容物分为3层,上层为少量淡黄色的贫血小板血浆,底层为深红色团块的红细胞,两层之间为黄色半透明状PRF凝胶,用镊子取出胶冻状凝块PRF,剪除下方的红细胞区即可得到所需PRF约1.5 ml。将收集到的PRF凝胶置于无菌的器皿中切成1～2 ml的碎片,与上述方法得到的AFG按照1∶10〔8〕的比例在器皿中混合均匀,然后转移到多个1 ml注射器中,同上述脂肪移植方法注射,注射后使用湿纱布覆盖按摩注射部位,使得脂肪颗粒均匀分布。剩余的脂肪均匀地铺在创面上,余下负压操作同对照组。

1.6术后处理 术后患者卧床休息,限制活动,吸脂区加压包扎,胰岛素控制血糖、抗生素预防感染,积极治疗原发病,7 d后拆除负压,观察创面情况,评估治疗效果,定期换药,待到创基情况良好后,采用刃厚皮片游离移植封闭创面。

1.7观察指标 7 d肉芽组织评分(拆负压时观察有无新鲜肉芽组织及肉芽覆盖创面面积比)。无新鲜肉芽组织,0分;<25%,1分;25%～50%,2分;>50%且≤75%,3分;>75%,4分;完全覆盖,5分)、14 d溃疡愈合率、愈合时间、总有效率(治愈:完全覆盖;显效:75%≤覆盖率<100%;有效:50%≤覆盖率<75%;无效:覆盖率<50%);总有效率=〔治愈数+显效数+有效数)/患者总数〕、疼痛评分〔采用视觉模拟评分(VAS),让患者选择感觉疼痛对应值〕。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件,计量资料采用独立样本t检验、单因素ANOVA检验;计数资料采用χ2检验;等级资料采用非参数检验。

2 结 果

共有18例患者治疗无效,其中6例因病情加重行截趾术,2例行小腿截肢术,余下患者因保肢意愿强烈拒绝截肢转为其他治疗或转院。治疗效果如图1所示。6例患者术后诉腹部不适,但不超过1 w,考虑为抽脂常见副作用。9例患者抽脂后出现局部伤口愈合不良,其中有2例出现腹部蜂窝组织炎,给予常规抗生素和换药处理后病情好转,无其他不良事件。与对照组比较,AFG组和PRF+AFG组创面愈合时间、VAS显著降低,7 d肉芽组织评分、14 d愈合率显著升高(P<0.05)。与AFG组比较,PRF+AFG组创面愈合时间显著降低,14 d愈合率显著升高(P<0.05)。3组总有效率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图1 PRF+AFG治疗DFU初始、14、28、40、45 d及创面愈合效果

表2 3组创面愈合时间、7 d肉芽组织评分、14 d溃疡愈合率、VAS及总有效率比较

3 讨 论

DFU是指糖尿病患者因周围神经异常和(或)外周血管疾病导致足部深部组织的感染、溃疡或破坏〔9〕,易出现坏死和截肢等并发症,病情危重时危及生命。由于病因不明、病理机制复杂,使得临床特征表现为难治愈、易复发、预后差〔10〕。目前外科常用的治疗方法是在全面清创的基础上,联合负压引流技术封闭创面,增强创面愈合。虽然形成相对密封的负压环境能有效牵拉收缩创面、扩张局部微血管、减少组织水肿,但这种单一疗法对于合并局部微环境紊乱导致的多种生长因子和生物活性物质缺乏的病变疗效甚微。研究表明〔11〕,负压联合自体脂肪移植能够治疗重度DFU患者,并取得较好疗效。究其原因可能与脂肪组织内富含多种脂肪因子(瘦素、抵抗素、生长因子及参与炎症反应相关细胞因子)和ADSCs相关,主要机制为:(1)脂肪组织以自分泌或旁分泌的形式分泌瘦素、脂联素、抵抗素等促伤口愈合相关肽与自身存储的活性生长因子(血管内皮生长因子、转化生长因子β及胰岛素样生长因子-1等)相互协同,激活下游磷脂酰激酶-3和核因子κB等途径,诱导血管内皮细胞的增殖和迁移,并上调血管内皮生长因子受体mRNA和基质金属蛋白酶mRNA及蛋白水平在血管内皮细胞中的表达,促进血管再生、肉芽组织形成。(2)组织内ADSCs能够促进角朊细胞和成纤维细胞的增殖、迁移,上调Ⅰ型和Ⅲ型胶原及纤维结合蛋白基因表达,增强胶原合成、上皮再生〔12〕。且Mazini等〔13〕研究指出,在负压情况下,ADSCs促进胶原合成、成纤维细胞迁移的能力会更强。(3)ADSCs能够抑制炎症细胞因子并刺激抗炎细胞因子的产生〔14〕,减少创面部位神经损伤性炎症,进一步缓解疼痛。本研究结果与上述探讨的机制一致。

虽然脂肪移植有诸多好处,但有研究表明,移植后距营养供应组织边缘超过300 μm的脂肪细胞在24 h内无法存活〔15〕,为了使其更好发挥作用,需解决脂肪移植后低存活率的问题。PRF作为新型的自体血小板生物材料,已在临床上治疗烧伤、脱发、骨关节炎、瘢痕等方面取得较好的疗效〔16〕。因其富含血小板、白细胞、生长因子、趋化因子、细胞因子且具有纤维蛋白立体结构〔17〕,有助于组织细胞的迁移、增殖和分化,具备良好的抗感染、促进组织再生修复等作用〔18〕。大量研究表明〔19～22〕,将PRF与AFG联合使用能够增加脂肪移植物的存活率,显著改善伤口愈合潜力,本研究得出相似结论。相关机制如下:(1)诱导ADSCs的增殖和分化,使得更多ADSCs分化为可直接参与再生和修复的细胞(成纤维细胞和角质形成细胞)〔23,24〕。(2)提供纤维蛋白支架,将血小板、白细胞、ADSCs黏附在支架基质蛋白上,并提供营养支持。减少细胞和活性物质的大量流失,延长其在局部的效应时间,使得组织拥有相对持久的生长因子来源〔25〕。(3)生成物理屏障,保护移植细胞受到免疫攻击〔26〕。(4)促进脂肪的早期血管化,从而逆转移植物的早期缺血阶段〔27〕。(5)释放抗炎趋化因子,减少创面局部的炎症和肿胀,减少移植细胞破坏〔28〕。但两者在7 d肉芽组织评分上无显著差别。这可以解释为在修复的整个过程主要是脂肪起关键作用,而缺少早期血管化的脂肪缺血凋亡是一个缓慢的过程。同理适用于两者在VAS上差别无统计学意义,再加上糖尿病患者周围神经病变导致足部感觉减弱或消失且长期疼痛出现了疼痛耐受、敏感性降低,患者对这种长期缓慢的差别不敏感,主观评价易产生误差。

同时,本文存在一定局限性与不足。第一:本研究观察组在总有效率上优于对照组,但差异无统计学意义,这可能与样本量偏少有关。虽然有研究指出〔29〕糖尿病本身为慢性消耗性疾病,机体内细胞和因子的含量和活性都会降低,自体提取物不足以改变伤口的愈合特性,但文章质量不高,证据不足以令人信服。后续希望有大样本研究进行验证。第二:脂肪和PRF的提取方法种类繁多,目前尚未探讨出最佳提取方式,本研究采用的是临床上广泛认可的ChouKroun法和Coleman技术,但可能不是最佳,希望后续能够进行多中心、高质量研究解决这一问题。第三:由于目前尚无高质量证据明确指出糖尿病患者脂肪移植后的存活率,笔者担心血供太差导致移植脂肪无法存活造成治疗效果不理想,所以本研究纳入对象都是踝肱指数较好患者,对于中重度DFU患者治疗效果没有进行深入探讨。第四:有研究指出〔30〕,单用PRF也可促进糖尿病足溃疡愈合,添加PRF组或许能更好评价联合治疗效果,但本研究旨在探讨脂肪联合PRF治疗相较于脂肪的疗效对比,且PRF与AFG属于不同的材料类型,目前关于DFU的临床与基础试验中未见将两者进行疗效比较,所以对该临床实践的指导价值不大,笔者未将其纳入分组,未来研究可以进行深入探讨。

综上,PRF联合脂肪移植能够有效促进移植脂肪的早期血管化,提高存活率,改善脂肪促伤口愈合的潜力,缩短愈合时间、减轻患者疼痛,可作为一种新的治疗方式应用于临床。