酸樱桃离体快繁体系研究

杨囡君

(商丘职业技术学院,河南 商丘 476100)

园艺学上的核果类是指植物分类学上蔷薇科李亚科Drupaceae(Prunoideae) 李属(PrunusLinn)果实为核果的一类果树[1],通常包括樱桃、桃、李、杏等,属于我国的果树生产方面重要的种类,其在生产上常采取种子繁殖和无性繁殖.种子繁殖简单易行、成本低廉,但苗木生产速度较慢,苗质较差,且易出现品种变异问题,这已成为制约核果类果树生产发展的限制因素[2].此外,核果类果树种质资源的保存采用田间保存的方法,占地面积大、管理经费高,而且一旦遇到环境的威胁或危害性病虫害,可能导致种质资源的丢失,而利用组织培养的方法可以克服上述的缺点.

樱桃的离体培养研究始于20世纪80年代[3-4],经过20多年的发展,目前已在茎尖和茎段培养、叶片离体培养、不定根培养、胚培养等许多领域都有较为关键的突破.

提升樱桃繁殖率可以运用茎尖、茎段进行培养,这在较短的时间内即可完成,还能够根据其特点进行分化而取得植株再生.总之,这一优势在无土苗木领域处于非常关键的地位.

本试验的目的是以我国核果类果树常用的砧木酸樱桃为试材,建立并完善其离体快繁体系,并保存这些果树的种质资源,为未来基础理论研究提供所需的批量化性状相同的试验苗木.同时,有助于苗木砧木生产方面的推广应用,给转基因工程打下良好的基础,也为合理保护核果类果树的种质资源及研究其离体保存技术做出贡献.

1 材料与方法

1.1 材料

酸樱桃 ‘CAB’砧木可以使接穗的花期推迟,从而可以避开晚霜期,使接穗不受冻害.其耐寒性、耐旱性较强,对土壤条件要求不高,实生繁殖时,根系发达,与甜樱桃品种的嫁接亲和力很强,且有矮化作用.

酸樱桃品种‘CAB’于2020年5月初由北京市的农业科学院林业果树研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 外植体处理

外植体是来自于酸樱桃根蘗苗的茎尖以及带腋芽的茎段部分外植体,经自来水冲洗完成后,分别剪制1 cm左右茎段,然后放置超净工作台中采用2种杀菌方法:1)75%乙醇30 s+0.1%升汞5 min;2)75%乙醇30 s+0.1%升汞7 min,再用无菌水冲洗5次,多余水分用无菌滤纸吸干[5-6].统计接种成活率:

成活率=接种成活外植体数/接种外植体总数×100%.

1.2.2 培养基及培养条件

初代培养基选择樱桃组织培养常用的MS[7-8](琼脂6 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、pH5.8)和F14(琼脂6 g·L-1、蔗糖20 g·L-1、pH5.4)培养基[1],[3].将培养基分装到100 ml三角瓶中,每瓶分装大约50 ml,在1标准大气压121℃下,保持压力15 min,高压灭菌.培养设定的光照强度是1800 lx-2000 lx,一天的光照时间是10 h,温度设定的是23±2℃.培养基配制、灭菌方法以及培养条件,下同.

1.2.3 增殖培养

增殖培养基以筛选出的初代培养基为基本培养基,添加不同浓度配比的生长素和细胞分裂素,共12种处理组合.其中,IBA设3个水平,分别为0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1;6-BA设4个水平,分别为0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1.

每个处理均接种10株,完成3次的重复,培养时间为1个月,再仔细察看,计算其增殖的系数、所产出的新梢的有效数量(指那些分化苗的长度是大于1 cm的植株)及所生长出的有效新梢的所占比的概率.

增殖的系数=参与进行的分化苗的总数量/实验所用接种的数量.

产出的有效新梢占比的概率=生产出的有效新梢的数量/参与进行的分化苗的总数量×100%.

1.2.4 生根培养及移栽基质的筛选

本试验主要运用了2种方式来开展具体的生根测试:

1) 采用高浓度的生长素苗基浸蘸的方式.用经过高压灭菌浓度分别为100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1的IBA浸蘸无菌植株的基部5 min、10 min、15 min、20 min、30 min,后将其接种到1/2MS空白培养基中,共15种处理.

2) 给1/2MS培养基添加浓度分别为0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1的IBA,共5种处理.

平均每种的接种数量都是30株.通过一个月的培育,计算其生根的数量(即参与生根的植株的数目数值)、产出生根的所占比概率、所参与生根的平均的根长度.

产出生根的所占比概率=所生根的数量/参与进行接种的总数量值×100%.

所生根的平均的根长度=总根共有的长度之和/所有的根数量.

挑选出长度大概为2 cm,并且根的长势大致相同的所生根苗,再进行3-5天的开盖炼苗后,再把苗拿出来,将根上面的琼脂清洗干净,随后将其放置进通过高压灭菌的河砂、蛭石以及营养土与蛭石比例是1∶1的基质里面.移入栽植的成活率与移栽后1周的温度及湿度有很大关系,因此在移栽时要保持温度适宜,且在移栽的第1周要注意保湿和通风,以提高成活率.

以上数据处理采用DPS数据处理分析软件进行分析.统计方法及数据处理方法,下同.

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法和培养基对成苗的影响

通过浓度0.1%升汞对外植体加以消毒处置.由于升汞对外植体存毒害,用此点进行了预检.预检测结果显示:消毒时间为5 min、7 min时,外植体成活的概率分别是66.9%和83.2%,所以消毒时间确定为7 min.

图1 不同培养基的初代培养

将选用的植株培养30天,这样其顶芽与茎段可以不再需愈伤组织的时间,就能直接长出新的不定芽.而被放置在MS培养基里面的那些无菌苗,呈现出翠绿的色泽,成长茂盛.处于F14培养基中的无菌苗,呈现出较重的玻璃化情况(如图1所示),生长点褐化死亡.F14也是比较经常采用的樱桃组织培养基,可在此次酸樱桃培育生长的时候,选用F14当作初代的培养基,这也造成呈现出茎尖的生长点形成了褐化死亡,以及还有玻璃化的严重情形,造成这些情形的原因是酸樱桃的基因类型跟其他的樱桃的品种属性可能存在差异性.另外,杨振国等[9]的酸樱桃玻璃化苗研究结论表明:蔗糖浓度为20 g·L-1时,约有1/5的酸樱桃出现了玻璃化苗,而且蔗糖浓度与玻璃苗的数量呈负相关,可见蔗糖含量的降低是导致F14培养基试管苗出现玻璃化的主要因素.因此,本试验所筛选出的MS培养基更适宜于培养初代酸樱桃.

2.2 不同浓度外源激素对酸樱桃增殖的影响

Wilkins[10]以前记载过BA与IBA均为酸樱桃的扩大繁殖十分适合采用的激素,所以本试验也把侧重点放在了浓度不一样的BA与IBA激素方面,主要分析它们分别在酸樱桃的实际生长以及扩大繁殖过程中所起到的成效,结果如表1所示.酸樱桃增殖培养基采用12个处理组合,结果表明,编号为1、2、3、4(其BA的浓度不一样,分别是0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1,而IBA的浓度一样,都是0.1 mg·L-1)的培养基在进行培养时,植株矮小,增殖系数低,且有黄化和死亡的情况发生;相反,在编号为7、8、11、12(其BA的浓度较高,BA浓度分别为1.5 mg·L-1、1.5 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1)的培养基内培养得酸樱桃,则增殖的系数很高.这一结果在编号为12(BA浓度是2.0 mg·L-1,IBA浓度是0.3 mg·L-1)的培养基内最为明显,其增殖的系数达到6.1,但因为该培养基的分裂素浓度也比较高,其分化苗也均呈现出程度不一的玻璃化.而在编号分别为5、6、9、10(其IBA浓度分别是0.2 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.3 mg·L-1)的培养基内,酸樱桃的分化苗生长势良好.其中,编号5的培养基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1)中的酸樱桃的增殖系数的数值达到了4.5,所产生出的有效的新梢(主要是指那些新梢长度在1 cm以上)的数值占比概率则是83.6%.可见,编号5的培养基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1)是酸樱桃增殖的最优培养基(如图2所示).编号是9的培养基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1)内的植株生长最是茁壮,都是节间产生的分化苗,将其同其他的培养基进行对比便会发现,这一培养基是最佳的适用酸樱桃健壮生长的培养基.

图2 离体增殖的酸樱桃苗

2.3 不同生根方式对酸樱桃生根的影响

苗基浸蘸方法对于酸樱桃生根产生的影响.酸樱桃苗基在100 mg·L-1IBA里分别浸泡20 min、30 min,以及在200 mg·L-1IBA浸泡5min后(如表2所示),生根效果均较好,生根率可达100%,平均根长5.1 cm-8.9 cm(如图3所示),即低浓度长时间浸蘸和高浓度短时间浸蘸均可达到较好的效果.但是当IBA浓度达到200 mg·L-1,处理时间20 min以上时,则无法生根,只形成大的愈伤组织.其原因可能是生长素可以促进根原基形成,而幼根的生长则不需要高浓度的生长素,否则会起到抑制根系的生长作用[11].

表2 苗基浸蘸方法对于酸樱桃生根产生的影响

图3 苗基浸蘸法生根苗

不同的IBA浓度对于酸樱桃生根产生的影响,如表3所示.酸樱桃以1/2 MS为基本培养基时,均有生根现象产生.在1/2 MS培养基上不添加任何生长调节剂也可以生根,说明酸樱桃较易产生根系.随着生长素IBA浓度的增加,产生根的概率也开始增加,IBA浓度继续增加后生根概率开始减少,平均根长也随之变短,出现大量的愈伤组织,即在高浓度生长素IBA的作用下,产生了大量的根原基.当IBA浓度为0.5 mg·L-1时,酸樱桃平均生根率达到了76.7%,根长平均为2.1 cm(如图4所示).比较两种生根方式可以发现:第一种苗基浸蘸法,比较容易生根而且根系也有较快的生长速度,这可以减少生根以及移植栽培的时间,但是操作过程比较繁杂;第二种普通生根法,操作过程比较容易,但生根的概率比较小,根系的生长速度也相对缓慢,需要一个月才能正常移植栽培.所以,选择哪一种生根的方法,可根据具体的情况和需求来定.

表3 不同的IBA浓度对于酸樱桃生根产生的影响

图4 普通生根法生根苗(1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1 )

2.4 不同移栽基质对酸樱桃试管苗成活率的影响

在移栽植株的生长状况、根长、移栽环境的温度都保持一致的情况下,各种基质中植株的移入栽植的成活概率也存在着较大的差别,如表4所示.如果基质是河砂的时候,移入栽植的成活概率最小,可达到20%;在蛭石∶营养土(1∶1)中,移栽成活率可达60%;蛭石中移栽成活率最高可达80%.由此可以得出,因河砂保水性太差,使刚刚移栽的新植株得不到充分的湿度,致使植株移栽成活率最低;蛭石∶营养土(1∶1)基质环境的透气性比单独使用蛭石差,使移栽新植株的根得不到更好的呼吸,可能导致根部腐烂,从而致使植株死亡.移栽30天后,长出新叶的植株移入温室,可全部成活.

表4 不同的基质对于酸樱桃的成活概率产生的影响

3 结论与讨论

3.1 结论

以酸樱桃春季根孽苗的茎尖和带腋芽的茎段为外植体,用浓度75%乙醇浸泡30 s,浓度0.1%升汞处理7 min,成活率可达83.2%;适合酸樱桃初代培养的基本培养基为MS培养基;最佳增殖培养基为MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1,增殖系数为4.5;最佳生根方式为 200 mg·L-1IBA浸蘸无菌苗基部5 min,生根率高达100%,平均根长8.6 cm;最佳移栽基质为蛭石,成活率可达80%.

3.2 讨论

3.2.1 植体的选择及杀菌处理

在组织培养的过程中,得到无菌株系是建立离体快繁体系最基础,也是最关键的一步.外植体本身的情况,例如品类特征、培育的阶段、年龄与生理情况、大小情况和其处在树体以及枝条部分的具体位置等等,都可以对外植体本身的细胞的全能属性以及组织部分的器官再生属性的表现产生影响.所以,筛选出比较适用的外植体,在繁殖微体的成功与否上有着非常关键的意义.

外植体常选用幼年型材料或成年树上的幼态部分,如靠近基部的萌生枝条、根孽条等[12].取本试验的酸樱桃的实生苗或者新生枝条等幼嫩材料作为外植体均能较快地建立起无菌培养体系.

常用的植物消毒灭菌剂有次氯酸盐、升汞、漂白粉、过氧化氢及抗生素.升汞灭菌效果最好,但其残留最难除去,而且对植物的组织来说伤害也较为明显,所以需要对它的消毒时长加以严格管控,通常不能让其消毒时长多于10 min,且使用浓度为0.1%-0.2%.针对不同时期、种类的外植体,应选择合适的消毒剂和消毒方法.

3.2.2 培养基的选择

酸樱桃和山杏的基本培养基为MS培养基,山桃和‘丽春’的基本培养基为G培养基,光核桃的基本培养基为MS-R培养基.

本试验选用常规F14培养基作为酸樱桃的初代培养基,但出现了死亡和玻璃苗,这可能是因为酸樱桃特殊的基因型所引起的.但杨振国等[9]的研究表明,蔗糖浓度为20 g· L-1时,可使1/5的酸樱桃出现了玻璃化苗,而且蔗糖浓度与玻璃苗的数量呈负相关.所以,也可以认为,出现玻璃苗的原因是F14培养基蔗糖含量低.

本试验筛选出了适合酸樱桃快繁的初代培养基和增殖培养基,实现了试验预期目标,为建立酸樱桃快繁体系打下了良好基础.但是,在试验中发现的一些问题还亟待解决,例如培养基易被污染的问题,这需要广大同仁们持续努力,不断优化试验程序步骤.