芬戈莫德增效多粘菌素B抗铜绿假单胞菌活性的发现

吴夏丽,黄 维,典灵辉

(1. 广东医科大学药学院, 广东 东莞 523000;2. 深圳市人民医院检验科,暨南大学附属第二临床医学院,南方科技大学第一附属医院,广东 深圳 518020)

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CarbapenemresistantPseudomonasaeruginosa,CRPA)已被世界卫生组织列为迫切需要开发新抗生素的最优先级关键性病原体之一[1]。多粘菌素B(Polymyxin B,PB)对包括CRPA在内的耐药革兰阴性菌具有良好的抗菌效果,被认为是治疗其感染的“最后一道防线”[1]。然而,PB的毒性及临床上出现的多粘菌素耐药是阻碍其临床应用的两个重要因素[2]。开发新的替代PB的抗生素是解决上述问题最有效的方式,但周期较长且成功率极低,而开发其增效剂则是一种很好的替代方案[3]。本研究通过对已知靶点化合物库的筛选发现芬戈莫德可增强PB的抗PA活性,具有与PB形成联合用药方案的潜能。

芬戈莫德(Fingolimod)的中文化学名称:2-氨基-2-[2- (4-辛烷基苯基) 乙基]-1, 3-丙二醇,分子式为C19H33NO2,分子量为307.5[4]。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器pEX18Tc质粒(本实验室);PB(批号: 155223,纯度: 8331 u·mg-1)、芬戈莫德(批号: 120173,纯度: 99.83%)、四环素(上海陶术,批号: 44913,纯度: ≥ 98.0%);肉汤培养基(批号: I718KA5488)、脑心浸出液肉汤(Brain Heart Infusion Broth,批号: 1021D031)培养基,噻唑蓝(MTT,批号: I720BA0002,纯度: ≥ 98.0%)、10%蔗糖平板(Tryptone yeast extract and sucrose,TYS10)、MgSO4(批号: F418BA0002,纯度: ≥ 98.0%)、E.coliDH5α感受态细胞(批号: B528413,上海生工);细菌总RNA提取试剂盒(批号: Y1510)、质粒提取试剂盒(批号: R7022)、细菌DNA提取试剂盒(批号: Y1626,天根生化);逆转录试剂盒(批号: HY-K0511A)、荧光定量PCR试剂盒(批号: HY-K0523,MedChemExpress)。

1.2 方法

1.2.1菌株和生长条件 菌株PA ATCC 27853购自美国典型培养物保藏中心,除特别提及外,液体培养基培养条件均为37 ℃ 220 r·min-1过夜振荡,固体培养基均为37 ℃静置培养。

1.2.2药物联合作用 棋盘滴定法检测药物联合作用。芬戈莫德与PB以不同比例混合后接种至过夜培养的PA培养液(浓度稀释至OD600=0.001),计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI),FICI ≤ 0.5被定义为具有协同作用[5]。

1.2.3PAsr的筛选 过夜培养的PA培养液接种至含1 mg·L-1PB及2 mg·L-1芬戈莫德的LB培养基至终浓度OD600=0.001培养过夜;将上述培养液继续接种至含1 mg·L-1PB及4 mg·L-1芬戈莫德的LB培养基至终浓度OD600=0.001培养过夜;如此反复,每一轮的PB浓度相同,芬戈莫德浓度加倍,直至细菌无法生长[6]。

1.2.4全基因组测序及数据分析 细菌基因组提取试剂盒提取基因DNA,使用 Illumina HiSeq 2500 平台搭配 de novo SPAdes Genome Assembler (版本3.12.0)[7]和Snippy (版本4.6.0)进行基因组比对及差异注释(https://github.com/tseemann/snippy)。

1.2.5点突变株的构建 使用pEX18Tc质粒,利用同源重组的方法构建携带G75T突变pmrB基因的点突变株PA-pmrBG75T。

1.2.6实时逆转录荧光定量PCR(Real-time reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR) 细菌总RNA提取试剂盒分别对处于对数期(OD600=0.8)的PA,PA-pmrBG75T及PAsr提取总 RNA后进行RT-qPCR实验。

1.3 统计学处理GraphPad Prism软件8.0版(La Jolla, California)进行统计分析,P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 芬戈莫德增强PB的抗PA活性PB与芬戈莫德联用时,其在PA中的FICI ≤ 0.188,表明两者具有协同作用;而芬戈莫德本身对PA无抗菌活性(MIC>200 mg·L-1)。

2.2 PAsr的全基因组测序如Tab 1所示,PAsr相对于野生株来说,其pmrB基因的第75位由G突变为了T,导致其编码蛋白的第25位发生了色氨酸对半胱氨酸的替代。

Tab 1 Whole genome sequencing of PAsr

2.3 芬戈莫德与PB在PAsr及PA-pmrBG75T中的联合作用在PAsr与PA-pmrBG75T中,芬戈莫德与PB联用时的FICI均为 ≥ 1.5,表明其增效作用消失。

2.4 受PmrB调控的基因表达水平与野生株相比,PAsr与PA-pmrBG75T的arnA、arnB、arnC、arnD、arnE、arnF、arnT、pmrA及pmrB基因的表达水平均显着增加,表明突变后导致PmrA/B的调控功能增强。

3 讨论

芬戈莫德是冬虫夏草提取物通过结构改造而成的一种新型免疫抑制剂[8]。本研究首次发现芬戈莫德可明显增强PB对PA的抗菌活性,联合使用后可明显降低PB的使用浓度,而其本身并不具备抗菌活性。由于芬戈莫德属于已上市药物,其安全性和可靠性已经过验证。因此,芬戈莫德与PB的联合使用方案具有良好的临床应用前景,有望克服PB因毒副作用而临床应用受限的难题。我们在对芬戈莫德与PB联合条件下的耐药株筛选并结合全基因组测序后发现,由pmrB基因的G75T突变导致的Trp25Cys氨基酸取代是个新的介导PA对PB耐药的突变形式,芬戈莫德对PB抗菌活性增效作用也同时消失。

综上所述,本研究发现了一个非抗生素类已上市药物芬戈莫德可增强PB的抗PA活性,为开发基于两者的联合用药方案提供了依据。