豨莶草提取物对脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用

吴慧玲,吴青青,陈景泉,周彬彬,余正双,杨泽霖,赖文芳,洪桂祝

(福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)

脑卒中是严重危害健康的重大慢性疾病,分为缺血性和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中占87%[1],是目前研究脑卒中的主要焦点。组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是一种溶栓药物,也是唯一获得FDA批准的治疗缺血性脑卒中的药物,但tPA治疗时间窗窄,超过4.5h后用药容易产生出血等不良反应。大量脑卒中候选药物在临床试验阶段以失败告终,其主要原因是药物作用机制单一(主要为神经保护)。研究普遍认为,基于神经保护与抗炎等多重药理作用的策略进行脑卒中药物研发,可提高研发成功的机会[2]。传统中药具有多成分、多靶点、多通路的协同调控作用,研究传统中药对脑卒中的作用,对从传统中药宝库挖掘脑卒中药物具有重要的实际应用价值。

豨莶草为我国传统中草药,味苦性辛寒,归于肝肾经。《中国药典》2020版记载,豨莶草的功能主治为“风湿痹痛,筋骨无力,腰膝酸软,半身不遂”。豨莶草在古代炮制,从事炮制中医均言要“九蒸九晒”,以治中风,“蜜酒九蒸九晒”治四肢麻痹,腰膝无力[3]。近年来,国内外学者越来越重视对豨莶草的研究,现代药理学证明,豨莶草对脑卒中、慢性疼痛、痛风性关节炎等疾病具有良好的治疗作用[4]。本文主要研究豨莶草提取物对MCAO大鼠的神经保护作用,并探讨其作用机制。

1 材料

1.1 实验动物上海斯莱克实验动物公司购入60只SPF级体质量(250～280)g的♂性SD大鼠(合格证号为2015000510392,实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2012-0002)。大鼠在福建中医药大学实验动物中心按SPF级别饲养,在动物实验开始前需对大鼠进行适应性喂养1周,可自由饮水与进食(动物使用许可证号为SYXK(闽)2014-0005)。

1.2 实验药物与主要试剂豨莶草(安国润德药业有限公司,C21103106),经福建中医药大学中药鉴定学教研室鉴定;NeuN抗体(ab177487),Cox IV抗体(ab202554)均购于Abcam;Bax抗体(#2772),Bcl-2抗体((#3498)均购于Cell Signaling Technology;β-actin抗体(Beyotime,AF0003);Tunel染色试剂盒(Promega,G3250);尼氏染色液(Leagene,DK0022)。

1.3 实验仪器YB-6LF型石蜡包埋机、HM325型石蜡切片机(美国Thermo Fisher公司);Mini PROTEAT Tetra型垂直电泳槽、Mini TransBlot型转印槽、ChemiDocXRS+型化学发光凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);LSM 880型激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)。

2 方法

2.1 MCAO模型制备和分组MCAO模型的制备参照课题组前期研究[5],采用线栓法造模,假手术组除不插入线栓外其余操作同模型组。Zea-Longa评分≥2为成模。成模大鼠随机分为模型(MCAO)组,豨莶草低、中、高剂量(即XXC-L、XXC-M、XXC-H)组,另设假手术(Sham)组,共5组,于MCAO造模2 h后灌胃。

2.2 给药治疗将豨莶草药材烘干,粉碎,8倍量70%乙醇浸泡2 h,加热回流提取3次,过滤,减压浓缩,得豨莶草提取物浸膏(1 g相当于12 g生药量)[6]。实验前用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液分别配制成浓度为0.025 kg·L-1、0.25 kg·L-1、2.5 kg·L-1的溶液。豨莶草给药剂量参照临床每日剂量12 g,以人60 kg体质量换算成大鼠每日剂量为1.82 g·kg-1,豨莶草低、中、高剂量组分别以0.1、1、10倍临床等效剂量给药,即0.182 g·kg-1、1.82 g·kg-1、18.2 g·kg-1;假手术组和模型组灌服等体积生理盐水,连续灌胃7天。

2.3 动物取材与前处理大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉采血。每组6只动物断头取脑,分离左右脑,迅速放入液氮中保存,将缺血侧左脑脑组织研磨成粉末,分装备用;每组6只动物心尖剪口,依次滴注生理盐水和4%多聚甲醛进行固定,取脑后,于4%多聚甲醛中固定24 h,使用脑模具和切片将脑组织均匀分为6片,置于70%乙醇浸泡保存,进行组织脱水、包埋及切片。

2.4 改良神经功能损伤(mNSS)评分各组大鼠分别在1,3,7天采用mNSS法对大鼠运动、感觉、平衡等方面综合评估,1～6分轻度损伤,7～12分中度损伤,13～18分重度损伤[7]。

2.5 核磁共振成像(MRI)检测大鼠缺血侧脑梗死体积各组大鼠在第7天使用异氟烷麻醉后,至扫描床上仰卧位固定,安装头部线圈。7.0T小动物核磁共振成像仪对大鼠脑部冠状定位扫描,设置T2W1增强系列[8],ImageJ软件计算大鼠缺血侧脑梗死体积。

2.6 Western blot检测大鼠缺血侧脑组织Bax、Bcl-2、NeuN蛋白表达冰盒上提取各组大鼠脑组织总蛋白,经SDS-PAGE分离,转膜,封闭2 h,一抗4 ℃孵育过夜,TBS清洗,二抗孵育1.5 h,ECL发光液显色,凝胶成像系统检测,分析灰度值,以目标蛋白与β-actin的灰度值比值作为目标蛋白的相对量。

2.7 Nissl染色法检测大鼠缺血侧脑组织Nissl阳性细胞数脑切片脱蜡复水后于恒温箱56 ℃焦油紫染色30 min,酒精灯加热至冒泡,去离子水洗涤,尼氏分化液分化,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜下观察神经元的情况。

2.8 免疫荧光染色法检测大鼠缺血侧脑组织Tunel阳性细胞数及NeuN的表达脑切片脱蜡复水、抗原修复,蛋白酶Κ工作液孵育20 min,PBS清洗,1×平衡液室温平衡20 min,TdT酶反应液室温避光孵育1 h,PBS清洗,DAPI染色4 min,PBS清洗,抗淬灭剂封片,激光共聚焦显微镜观察、摄取图像。阳性细胞百分比/%=阳性细胞数/总细胞×100%。

经过脱蜡复水、抗原修复的脑切片用5%BSA室温封闭2 h,PBS清洗,NeuN一抗4 ℃孵育过夜,次日室温放置40 min,PBS清洗,湿盒孵育荧光二抗2 h(之后均需在避光条件下操作),PBS清洗,DAPI染色4 min,PBS清洗,抗淬灭剂封片,在镜下随机选取5个视野观察、拍照,Zen Light软件进行分析。

2.9 RT-qPCR检测大鼠缺血侧脑组织mRNA表达采用TRIzol法提取总RNA,逆转录成cDNA,用RT-qPCR检测mRNA表达水平,以GAPDH为内参计算2-ΔΔCt值。所用引物参照GenBank中大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6引物序列,由上海尚亚生物技术公司提供,详细信息见Tab 1。

3 结果

3.1 豨莶草提取物降低MCAO大鼠mNSS评分

mNSS评分结果表明,第1 天,MCAO组大鼠评分显著高于Sham组(P<0.01),提示MCAO模型成功;第3 天,XXC-H组评分低于MCAO组(P<0.05);第7 天,XXC-M和XXC-H组评分显著低于MCAO组(P<0.01),提示豨莶草提取物能改善MCAO大鼠神经功能损伤(Fig 1)。

Tab 1 Sequence of primers

3.2 豨莶草提取物降低MCAO大鼠缺血侧脑梗死体积经干预7天后,MCAO组大鼠缺血侧脑组织梗死体积高于Sham组(P<0.01),XXC-M和XXC-H组能显著降低缺血侧脑梗死体积(P<0.01),作用优于XXC-L组,且XXC-M和XXC-H组间无明显区别,因此选择XXC-M组作为后续研究的剂量(Fig 2)。

3.3 豨莶草提取物促进MCAO大鼠缺血侧脑组织Nissl阳性细胞数经干预7 天后,Sham组大鼠脑组织神经元的尼氏小体表达较多且细胞形态正常;MCAO组大鼠缺血侧脑组织神经元的核出现皱缩,尼氏小体表达降低(P<0.01);XXC-M组大鼠缺血侧脑组织神经元形态以及尼氏小体数量均有显著恢复(P<0.01),提示豨莶草提取物能促进MCAO大鼠缺血侧脑组织中神经元形态和数量(Fig 3)。

Fig 1 Effect of Herba siegesbeckiae extract on

3.4 豨莶草提取物抑制MCAO大鼠缺血侧脑组织神经细胞凋亡经干预7天后,MCAO组大鼠缺血侧脑组织皮质细胞凋亡(Tunel)数目高于Sham组(P<0.01);与MCAO组比较,XXC-M组能明显减少皮质细胞凋亡数目(P<0.01)(Fig 4a)。同时,MCAO组大鼠缺血侧脑组织Bax增加、Bcl-2降低(P<0.05,P<0.01);XXC-M组能明显逆转Bax和Bcl-2表达(P<0.01)(Fig 4b),提示豨莶草提取物能抑制MCAO大鼠缺血侧脑组织神经细胞凋亡。

Fig 2 Effect of Herba siegesbeckiae extract on volume of ischemic cerebral infarction in MCAO

Fig 3 Effect of Herba siegesbeckiae extract on number of Nissl positive cells in ischemic brain tissue of MCAO

3.5 豨莶草提取物促进MCAO大鼠缺血侧脑组织神经元核抗原NeuN表达经干预7天后,Sham组大鼠脑组织皮层NeuN阳性细胞较多;MCAO组大鼠缺血侧脑组织NeuN阳性细胞显著减少(P<0.01);与MCAO组比较,XXC-M组NeuN阳性细胞显著增加(P<0.01)(Fig 5a)。同时,MCAO组大鼠缺血侧NeuN蛋白显著低于Sham组(P<0.01);与MCAO组比较,XXC-M组NeuN蛋白显著升高(P<0.01)(Fig 5b),提示豨莶草提取物能改善MCAO大鼠神经元损伤,发挥神经保护作用。

Fig 4 Effect of Herba siegesbeckiae extract on neuronal apoptosis in ischemic brain tissue of MCAO

Fig 5 Effect of Herba siegesbeckiae extract on expression of NeuN in ischemic brain tissue of MCAO

3.6 豨莶草提取物抑制MCAO大鼠缺血侧脑组织炎症因子表达经干预7天后,MCAO组大鼠缺血侧脑组织IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表达水平显著高于Sham组(P<0.01);与MCAO组比较,XXC-M组能降低以上mRNA表达(P<0.01),提示豨莶草提取物能抑制MCAO大鼠缺血侧脑组织炎症因子表达(Fig 6)。

Fig 6 Effect of Herba siegesbeckiae extract on expression of IL-1β,TNF-α and IL-6 mRNA in ischemic brain tissue

4 讨论

缺血性中风是一种复杂的脑部疾病,可通过破坏大脑内稳态导致严重的神经损伤。MCAO模型是最接近模拟人类缺血性中风的模型之一,因此本研究采用该模型来探讨豨莶草提取物对MCAO大鼠的神经保护作用。在实验过程中,首先采用mNSS评估神经功能损伤程度,MRI测脑梗死体积,研究结果表明,豨莶草提取物干预7天,显著改善MCAO大鼠mNSS评分,降低梗死灶。同时观察到中剂量组与高剂量组在药效上没有明显差异,因此选择中剂量作为后续实验研究。

脑缺血后,神经元的存活在功能恢复中起着重要作用,NeuN是成熟神经元标记物,常被用于直接评估神经元的死亡或丢失以及成为定量治疗效果的可靠标志物[9]。通过免疫荧光和Western blot结果发现,MCAO大鼠缺血侧脑组织NeuN表达受抑制,经豨莶草提取物干预7天后,能够改善MCAO大鼠NeuN表达,表明豨莶草提取物可以减轻MCAO大鼠的神经元损伤。为进一步探讨豨莶草提取物发挥神经保护的作用机制,我们检测了MCAO模型大鼠缺血侧脑组织Bcl-2和Bax的表达情况。细胞凋亡是脑缺血神经元损伤过程的关键细胞事件,其中Bcl-2家族的抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax是细胞凋亡途径的重要信号分子,通过调控线粒体功能障碍调节细胞凋亡[10]。研究结果发现,经豨莶草提取物干预7天后,大鼠缺血侧脑组织皮质细胞凋亡数目减少,结合Western blot结果,豨莶草提取物能抑制Bax,促进Bcl-2,表明豨莶草提取物对脑缺血/再灌注后诱发的缺血侧脑组织神经细胞凋亡有明显的抑制作用。脑内炎症是脑缺血后继发性损伤机制之一,炎症反应在脑卒中急性期加快缺血性损伤的形成并影响神经元死亡和神经组织再生[11]。本研究发现豨莶草提取物能显著降低MCAO大鼠缺血侧脑组织IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表达,提示豨莶草提取物能抑制MCAO炎症因子释放,改善缺血性脑损伤。

综上所述,豨莶草提取物能降低MCAO大鼠脑梗死体积,改善神经功能损伤,抑制神经细胞凋亡,减轻脑内炎症反应,对MCAO大鼠具有神经保护作用。